鈣離子結合蛋白S100A4的原核表達純化以及S100A6單克隆抗體的制備.pdf

1、肝臟是人體最大的消化器官,主要負責維持新陳代謝的正常進行。由于肝臟參與食物消化這一特殊功能,使其極易發(fā)生病變,引起包括急性肝衰和肝臟纖維化等發(fā)病率和死亡率都較高的疾病的發(fā)生,從而引起人們的重視。通過CCl4誘導的小鼠急慢性肝損傷模型和基因芯片等技術手段,我們深入探討了肝臟損傷修復的原理和機制,從而獲得治療肝損傷的全新思路和藥物靶點。其中S100家族隨著肝臟損傷修復過程呈現(xiàn)的規(guī)律性的表達變化,使其成為我們的重點研究對象。
　　本文以

2、S100家族為切入點,主要包括兩部分的研究內容:重組人S100A4的原核表達純化及活性測定和S100A6單克隆抗體的制備。S100A4是S100蛋白家族的成員,在細胞的增殖,分化,損傷修復以及腫瘤細胞轉移等方面發(fā)揮重要的調控作用。本研究將S100A4全長基因構建到pET28a原核表達載體上,利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達和純化出高純度的重組人S100A4。通過試驗證明,重組人S100A4蛋白在體外可以有效的增強黑色素瘤細胞A375-S2的增殖

3、。重組人S100A4原核表達與純化方法的建立將促進其結構和生物學功能研究,并且對于S100蛋白家族其他蛋白的表達與純化具有重要的參考意義。并且可用于后期對肝臟纖維化模型的藥效和藥理研究。為了制備抗人S100A6的單克隆抗體,利用原核表達純化后所得純度>97％的hS100A6為抗原,與弗氏佐劑相結合免疫Balb/c小鼠。利用雜交瘤技術,處死免疫小鼠,取脾細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞融合,利用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤。采用Elisa檢

4、測,并用有限稀釋法篩選出分泌特異抗人S100A6抗體的雜交瘤細胞株。腹腔注射同種小鼠誘導腹水產生,并應用Protein G親和層析法進行抗體純化。采用單克隆抗體可變區(qū) VH和VL基因組測序,為抗體可變區(qū)分區(qū);通過Elisa、Western Blot鑒定該單克隆抗體。結果獲得2株可穩(wěn)定分泌小鼠抗人 S100A6的單克隆抗體,分別命名為5-1G,8-6G。Elisa和Western Blot分析表明該2株單抗均能特異性識別 hS100A6。