S100A13基因真核表達載體的構(gòu)建及生物學性狀的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建以綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)為報告基因的重組表達質(zhì)粒PcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,瞬時轉(zhuǎn)染觀察其在COS-7細胞中的表達及亞細胞定位;以瞬時轉(zhuǎn)染實驗為基礎(chǔ),轉(zhuǎn)染HepG2細胞篩選獲得穩(wěn)定表達S100A13基因的細胞系,對比研究轉(zhuǎn)染前后HepG2細胞生物學性狀的變化及對抗癌藥物敏感性的差異。
　　方法:從甲狀腺癌組織中提取總RNA,采用RT-PCR技術(shù)擴增

2、S100A13基因的編碼區(qū)序列,回收PCR產(chǎn)物連接入克隆載體(pGEM-T載體)。擴增,質(zhì)粒提取,酶切并測序鑒定。設計帶6個組氨酸標簽的上游引物,以第一輪克隆質(zhì)粒為模板, PCR擴增產(chǎn)物亞克隆入PcDNA3.1/NT-GFP-topo vector,并進行測序鑒定。提取測序鑒定后的真核表達載體采用脂質(zhì)體介導瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞,熒光顯微鏡下觀察該基因亞細胞定位,RT-PCR驗證重組S100A13 mRNA的表達;以轉(zhuǎn)染COS-7細胞實

3、驗參數(shù)為基礎(chǔ),脂質(zhì)體介導穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細胞,G418篩選獲得穩(wěn)定表達重組S100A13基因細胞系,觀察該基因在HepG2細胞的定位,RT-PCR和Western-blot驗證重組S100A13 mRNA和蛋白的表達。半定量RT-PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前后細胞 FGF1表達量的變化;MTT法觀察轉(zhuǎn)染后細胞的生長曲線;加入化療藥物5-Fu處理后,流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡率的差異。
　　結(jié)果:酶切和測序結(jié)果證實重組質(zhì)粒含有S100

4、A13編碼區(qū)序列且插入方向正確, RT-PCR證實了S100A13基因在COS-7細胞中的表達,重組S100A13基因在COS-7細胞中亞細胞定位于全胞漿。
　　RT-PCR和Western-blot表明重組S100A13基因在HepG2細胞中穩(wěn)定表達,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光均勻分布于整個細胞。半定量RT-PCR表明轉(zhuǎn)染PcDNA3.1/NT-GFP-S100A13組 FGF1表達量明顯高于陰性對照組及空載體組。但各組細胞的生長

5、曲線以及對化療藥物(5-Fu)的敏感性無顯著差異。
　　結(jié)論:成功克隆了S100A13基因編碼區(qū)序列,構(gòu)建了其真核表達載體,該載體分別在COS-7細胞中瞬時表達和HepG2細胞中穩(wěn)定表達成功,S100A13基因在COS-7中亞細胞定位于胞漿而在HepG2細胞中亞細胞定位于整個細胞。S100A13及其介導釋放的FGF1在腫瘤的增殖及對抗癌藥物的敏感性方面均不具有明顯的作用,這可能預示著S100A13通過促進FGF1的釋放,在腫瘤局部