HNF4及其配體棕櫚酸在肝細(xì)胞中對(duì)ACAT2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié).pdf

1、心血管疾病是威脅人類(lèi)生存和影響生存質(zhì)量的重要疾病，在發(fā)達(dá)國(guó)家，心血管疾病已經(jīng)超過(guò)腫瘤，成為威脅人類(lèi)生存的第一殺手。心血管疾病往往伴隨動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，而在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生中，血中膽固醇水平的改變被認(rèn)為是重要的始動(dòng)因素。因此，研究膽固醇的代謝，對(duì)于理解動(dòng)脈粥樣硬化有重要意義。
　　 ACAT是脂酰輔酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(acyl-coA cholesterol acyltransferase)，催化膽固醇和脂酰輔酶A生成膽

2、固醇酯，加上的脂肪酸烴鏈?zhǔn)鼓懝檀减サ氖杷暂^游離性膽固醇的疏水性大大增加，分子間可以通過(guò)疏水性相互作用大量堆積在一起，極大地增加了堆積密度。ACAT分為ACAT1型和ACAT2型。ACAT1幾乎在所有組織中有表達(dá)，而ACAT2只在肝腸組織中表達(dá)。ACAT2催化的膽固醇酯由于有很強(qiáng)的疏水性，在肝中可以與甘油三酯，ApoB組裝成VLDL顆粒并分泌到血中。ACAT2被認(rèn)為與血中LDL中的膽固醇酯水平緊密相關(guān)：在細(xì)胞水平，ACAT2在肝細(xì)胞的過(guò)

3、表達(dá)可以促進(jìn)VLDL和ApoB的分泌；在動(dòng)物水平ACAT2來(lái)源的膽固醇酯被認(rèn)為是血液中致動(dòng)脈粥樣硬化的主要酯類(lèi)，ACAT2的敲除鼠肝臟中VLDL和ApoB的分泌減少，血液中膽固醇酯水平明顯降低，并且對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化有抵抗作用；通過(guò)寡核苷酸的方法干擾小鼠肝臟ACAT2之后，ApoB的分泌減少，血液中膽固醇酯顯著降低，小鼠對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊抵抗能力增強(qiáng)。因此，ACAT2被認(rèn)為是很有潛力的治療靶點(diǎn)?；贏CAT2對(duì)于膽固醇代謝的明確作用，研究

4、ACAT2的調(diào)控具有重要意義。雖然已經(jīng)知道ACAT2可以受到膽固醇別構(gòu)效應(yīng)的調(diào)節(jié)，但是，關(guān)于ACAT2是否受到不同因素引起的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還沒(méi)有報(bào)道。為了觀察不同的飲食和營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)于膽固醇酯代謝的調(diào)節(jié)作用，我們對(duì)ACAT2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行了研究。
　　 首先，我們構(gòu)建了ACAT2的報(bào)告基因，通過(guò)觀測(cè)其在肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性，我們發(fā)現(xiàn)ACAT2的啟動(dòng)子在非肝細(xì)胞中本底轉(zhuǎn)錄水平很低，這與其啟動(dòng)子上不含經(jīng)典的TATA box相一致

5、；在肝細(xì)胞中ACAT2的轉(zhuǎn)錄活性主要受肝特異性因子調(diào)控。通過(guò)構(gòu)建一系列截短的啟動(dòng)子的報(bào)告基因并在肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞中觀察活性，我們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)可能的HNF4的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)報(bào)告基因，我們發(fā)現(xiàn)HNF4可以增加ACAT2啟動(dòng)子的活性。通過(guò)構(gòu)建結(jié)合位點(diǎn)突變的報(bào)告基因，以及通過(guò)EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了HNF4可以通過(guò)這兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合到ACAT2的啟動(dòng)子上發(fā)揮作用。這兩個(gè)位點(diǎn)中，位點(diǎn)Ⅰ在-780～-790bp的位置，位點(diǎn)Ⅱ在-20～-30bp

6、的位置，位點(diǎn)Ⅱ的突變導(dǎo)致報(bào)告基因的活性完全缺失，與PGL3-Basic相當(dāng)，我們認(rèn)為HNF4可能通過(guò)該位點(diǎn)維持基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，而通過(guò)位點(diǎn)Ⅰ增強(qiáng)ACAT2的表達(dá)。另外，通過(guò)腺病毒過(guò)表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)HNF4可以顯著上調(diào)ACAT2的表達(dá)，而在逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的HNF4干擾的穩(wěn)定克隆細(xì)胞系中，ACAT2顯著下調(diào)。這些實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了HNF4對(duì)ACAT2具有上調(diào)作用。
　　 脂肪酸可以分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。這兩類(lèi)脂肪酸對(duì)于膽固醇代謝的影響已有

7、很多研究。一般認(rèn)為，飽和脂肪酸可以顯著上調(diào)血液中LDL-膽固醇的含量。脂肪酸可以作為HNF4的配體發(fā)揮作用，因此我們?cè)O(shè)想飽和脂肪酸調(diào)節(jié)ACAT2，進(jìn)而通過(guò)改變ACAT2的表達(dá)量影響到膽固醇的代謝。為了觀察飽和脂肪酸處理細(xì)胞對(duì)ACAT2表達(dá)的影響，我們選用生理狀態(tài)下飽和脂肪酸含量最高的棕櫚酸處理人肝細(xì)胞系HepG2和HuH7和原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸非常明顯地上調(diào)ACAT2的表達(dá)，而在對(duì)照BSA組和不飽和脂肪酸油酸處理組，ACAT