陸地棉BTB蛋白的生物信息學(xué)分析、克隆和功能初步研究.pdf

1、棉花（Gossypium L.）是全球重要的經(jīng)濟(jì)作物，是天然紡織工業(yè)的主要原料。隨著紡織技術(shù)的發(fā)展以及人們生活水平的提高，紡織工業(yè)對棉纖維品質(zhì)的要求愈來愈高，尤其是需要纖維比強(qiáng)度更高的棉纖維。棉纖維品質(zhì)改良現(xiàn)已成為棉花生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重要熱點(diǎn)問題。棉纖維發(fā)育過程可分為四個(gè)階段：起始分化期、伸長期、次生壁加厚期和脫水成熟期，其中次生壁加厚期與棉纖維的比強(qiáng)度形成關(guān)系密切。成熟棉纖維主要結(jié)構(gòu)是細(xì)胞壁，在植物中細(xì)胞骨架引導(dǎo)細(xì)胞壁的合成。BT

2、B蛋白家族是類Kuppel鋅指蛋白家族之一，能夠通過引導(dǎo)細(xì)胞骨架的形成和發(fā)展而影響細(xì)胞壁的合成，進(jìn)而影響整個(gè)棉纖維品質(zhì)的形成。
　　本研究在對陸地棉基因組中BTB蛋白家族進(jìn)行鑒定和系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上，以陸地棉纖維高斷裂比強(qiáng)度品系69307和低斷裂比強(qiáng)度品系69362為試驗(yàn)材料，克隆了GhBTB1基因，并對該基因的功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，初步揭示GhBTB1基因在陸地棉纖維發(fā)育過程中的功能。其研究結(jié)果如下：
　　1.陸地棉BTB蛋白

3、進(jìn)化關(guān)系的系統(tǒng)分析。本研究通過生物信息學(xué)比對從陸地棉(G.hirsutum L.)蛋白庫中鑒定出了10個(gè)BTBs基因，按聚類分析分為3個(gè)亞家族；并系統(tǒng)分析了家族成員的基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、基本理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明BTB蛋白家族在進(jìn)化上具有高度保守性，為進(jìn)一步研究棉花BTB蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。
　　2.GhBTB1的克隆。利用同源克隆方法克隆了GhBTB1的全長cDNA，對其基本理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)該蛋白的相對分子質(zhì)量為49.4

4、88kD，理論等點(diǎn)電為5.73，屬于疏水蛋白，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定；二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白主要由α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等組成；信號肽預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有信號肽，也沒有跨膜結(jié)構(gòu)，推測該蛋白可能屬于非分泌蛋白?；蜻M(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與可可蛋白屬于同一分支，與雷蒙德氏棉親緣關(guān)系比較近，并且該蛋白與擬南芥、水稻的相似性為77.42％，說明GhBTB1蛋白結(jié)構(gòu)具有高度保守性。
　　3.GhBTB1表達(dá)模式分析。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分

5、析顯示，在材料69307中20DPA表達(dá)量達(dá)到峰值，在材料69362中30DPA表達(dá)量達(dá)到峰值，結(jié)果表明GhBTB1在棉纖維細(xì)胞發(fā)育過程的次生壁加厚期具有優(yōu)勢表達(dá)特性。
　　4.GhBTB1功能初探。將該基因與PBI121載體連接，置于35S強(qiáng)啟動(dòng)子下游構(gòu)建了真核過表達(dá)載體，成功轉(zhuǎn)化野生型擬南芥；通過抗生素卡那霉素抗性篩選和PCR擴(kuò)增，獲得了轉(zhuǎn)基因型擬南芥；并觀察了T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型變化。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥植株比野生型