陸地棉FLOWERING LOCUST同源基因GhFT1的克隆及功能分析.pdf

1、開(kāi)花具有重要的生理意義，是顯花植物能夠成功生殖的關(guān)鍵條件。其中編碼磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP)的FLOWERING LOCUS T(FT)基因在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過(guò)程中起著重要作用。FT基因在葉片中表達(dá)并翻譯成蛋白后，經(jīng)韌皮部進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸至頂端分生組織，與FLOWERING LOCUSD(FD)蛋白形成復(fù)合物，促進(jìn)下游花身份相關(guān)基因APETALA

2、1(AP1),LEAFY(LFY),SUPPERSSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)，F(xiàn)RUITFULL(FUL)等的表達(dá)，促使植物早花。
　　目的：對(duì)棉花成花素基因GhFT1進(jìn)一步克隆和功能分析，明確GhFT1基因在棉花中的表達(dá)模式，對(duì)不同倍性的棉花FT基因進(jìn)行多態(tài)性分析，為深入研究GhFT1基因功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法：基因克隆采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，基因全長(zhǎng)克隆采

3、用PCR技術(shù)；基因表達(dá)分析采用半定量RT-PCR和quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)技術(shù)；構(gòu)建植物表達(dá)載體35S::GhFT1、35S::GhFT1-GFP，并通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，將35S::GhFT1轉(zhuǎn)化突變體 ft-10。將轉(zhuǎn)化35S::GhFT1-GFP擬南芥幼苗用20％的蔗糖處理后進(jìn)行激光共聚焦亞細(xì)胞定位分析。
　　結(jié)果：⑴將本實(shí)驗(yàn)室前期克隆的棉花成花素基因GhFTL1進(jìn)行重新克隆，在

4、本研究中該基因命名為GhFT1。首次擴(kuò)增出GhFT1基因5′非編碼區(qū)，將擴(kuò)增的序列與本實(shí)驗(yàn)室前期得到序列進(jìn)行拼接發(fā)現(xiàn)GhFT1基因的cDNA全長(zhǎng)為818 bp，編碼174個(gè)氨基酸。GhFT1基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，全長(zhǎng)為3151 bp。氨基酸比對(duì)分析表明GhFT1蛋白具有保守的PEBP家族保守基序、2個(gè)保守的關(guān)鍵氨基酸絡(luò)氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)、以及 FT家族中促進(jìn)開(kāi)花的保守片段 B。系統(tǒng)進(jìn)化分析說(shuō)明GhFT1與可可的TcP

5、EBP蛋白親緣關(guān)系近，屬于FT-like亞家族成員。⑵GhFT1在棉花的不同組織中均有表達(dá)，在花器官、莖和葉片中的表達(dá)量要高于其他組織；GhFT1在棉花纖維起始期和延長(zhǎng)期表達(dá)量逐漸升高；GhFT1隨著棉花的生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)量逐漸升高；GhFT1基因在長(zhǎng)短日照條件下，表現(xiàn)出現(xiàn)晝夜節(jié)律表達(dá)模式。⑶四倍體陸地棉、二倍體雷蒙德氏棉和亞洲棉的FT基因都是由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，其中四倍體陸地棉和二倍體雷蒙德氏棉的氨基酸序列相同，同亞洲棉只有一個(gè)

6、氨基酸不同。陸地棉FT基因相對(duì)拷貝數(shù)為4，雷蒙德氏棉與亞洲棉的FT基因相對(duì)拷貝數(shù)為2。⑷成功構(gòu)建了GhFT1基因的原核表達(dá)載體，目的基因能夠在大腸桿菌中大量表達(dá)融合蛋白，并以包涵體和可溶蛋白的形式存在。ELISA檢測(cè)表明抗體血清與純化的GhFT1重組蛋白有良好的免疫反應(yīng)性。⑸擬南芥中異位過(guò)量表達(dá)GhFT1基因在長(zhǎng)日照和短日照條件下均可促進(jìn)擬南芥開(kāi)花。qRT-PCR分析表明發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過(guò)表達(dá)GhFT1可促進(jìn)擬南芥花身份基因AP1，LFY

7、，SOC1，F(xiàn)UL的表達(dá)。GhFT1可部分互補(bǔ)突變體ft-10的晚花表型，使突變體的開(kāi)花時(shí)間提前。⑹GhFT1蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，35S::GhFT1-GFP融合表達(dá)載體在擬南芥中過(guò)表達(dá)同樣可使擬南芥出現(xiàn)早花表型。
　　結(jié)論：GhFT1是陸地棉FT的同源基因，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?25 bp，編碼174個(gè)氨基酸。在二倍體棉花中有2個(gè)拷貝，而在四倍體棉花中則有4個(gè)拷貝。GhFT1在棉花各組織中均有