新基因AK078438的生物信息學(xué)分析和初步功能研究.pdf

1、目的：小鼠基因AK078438是與血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的未知功能基因之一，通過網(wǎng)上比對(duì)而獲得的。本論文就小鼠基因AK078438作些生物信息學(xué)分析和初步的功能研究，為今后該基因功能的進(jìn)一步研究和抗腫瘤的血管生成治療找尋新的靶點(diǎn)。 方法：通過生物信息學(xué)的方法分析了小鼠基因AK078438的開放閱讀框的位置，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)擴(kuò)增出基因的全長(zhǎng)開放閱讀框(open reading—frame，ORF)，驗(yàn)證網(wǎng)上公布的

2、該基因編碼區(qū)。進(jìn)一步進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和同源分子進(jìn)化樹分析，并利用GENSCAN和TWINSCAN軟件預(yù)測(cè)了該基因在小鼠基因組中的定位和外顯子及內(nèi)含子的情況。使用RPS-BLAST在線服務(wù)器分析了該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；使用SignMP 3.0 Server分析該蛋白的信號(hào)肽；TMHMM-2.0在線服務(wù)分析了該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)，并進(jìn)一步分析了其蛋白的疏水性。利用SMART在線工具搜索發(fā)現(xiàn)該蛋白的化學(xué)修飾位點(diǎn)，為其是否參與酶活性調(diào)節(jié)提供參考依據(jù)

3、。運(yùn)用RT—PCR技術(shù)在mRNA水平上檢測(cè)該基因在正常小鼠組織、腫瘤細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞的分布。并構(gòu)建該綠色熒光融合蛋白的真核載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察該蛋白在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。用原核載體表達(dá)該基因的融合蛋白，親和層析純化該蛋白，并分析其理論的分子量是否相符，為制備多抗血清、研究其蛋白質(zhì)的相互作用，找尋其參與的信號(hào)途徑提供條件。用MTT和流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)該基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的凋亡作用。 結(jié)果：該基因全長(zhǎng)ORF證實(shí)為1065bp，編碼3

4、55個(gè)氨基酸，與網(wǎng)上公布的編碼區(qū)相符合，原核表達(dá)的蛋白與理論預(yù)期的分子量大小相符。該蛋白與多種真核生物具有較高的同源性，在進(jìn)化過程中保守并與種屬親緣性相關(guān)。該基因定位于小鼠的4號(hào)染色體4qAl，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，在小鼠的基因組中由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成。進(jìn)一步分析得到了蛋白的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)锽AR和未知功能的DUF1208，無信號(hào)肽，為非分泌型蛋白，具有一些化學(xué)修飾位點(diǎn)。通過實(shí)驗(yàn)方法得到在mRNA水平上，該基因表達(dá)于小鼠的大腦、子宮、結(jié)腸、腎

5、臟、睪丸和骨髓，而在心臟、脾臟、肺、肝臟、胃中不表達(dá)；在小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株C26、黑色素瘤細(xì)胞株B16、小鼠Lewis肺癌LL/2，間充質(zhì)干細(xì)胞中均有表達(dá)，在小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa，小鼠骨髓細(xì)胞瘤NS-1中不表達(dá)。該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。MTT和流式細(xì)胞術(shù)的方法初步檢測(cè)到該基因具有一定的凋亡功能，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)論：借助于生物信息學(xué)方法了解了AK078438基因可能的性質(zhì)和功能，通過研究該基因的蛋白表達(dá)、亞細(xì)胞定位、表達(dá)譜分析、