骨髓和胎盤基蛻膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞在小腸黏膜下層三維培養(yǎng)體系中成心肌樣細(xì)胞分化能力比較.pdf

1、目的:比較骨髓和胎盤基蛻膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSCs)在小腸粘膜下層(small intestinal submucosa，SIS)三維培養(yǎng)體系中的成心肌樣細(xì)胞分化能力，為心肌組織工程種子細(xì)胞的篩選提供理論依據(jù)。
　　方法:分別從人骨髓和胎盤基蛻膜組織中分離提取間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bo

2、ne marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)和胎盤基蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞(pacental deciduabasalis-mesenchymal stem cells， PDB-MSCs)中細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。采用成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)分化的方法鑒定BM-MSCs和PDB-MSCs的多向分化潛能。將BM-MSCs和PDB-MSCs分別在SIS上復(fù)合培養(yǎng)5d，待形成細(xì)胞支架復(fù)合物后將復(fù)合

3、物隨機(jī)分為4組，分別是BM-MSCs-SIS誘導(dǎo)組、BM-MSCs-SIS非誘導(dǎo)組、PDB-MSCs-SIS誘導(dǎo)組和PDB-MSCs-SIS非誘導(dǎo)組。其中所有誘導(dǎo)組中的復(fù)合物在使用成心肌樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑5-氮胞苷（5-azacytidine，5-aza）作用24h后更改為普通完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4w。非誘導(dǎo)組中復(fù)合物不添加5-aza，而是用等量的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替，其它操作同誘導(dǎo)組

4、。4w后，掃描電鏡(scanning electron microscope， SEM)觀察BM-MSCs和PDB-MSCs在SIS中的形態(tài)變化;抗人cTnⅠ的免疫熒光染色顯示兩種細(xì)胞的成心肌樣細(xì)胞分化現(xiàn)象;流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)兩種細(xì)胞的分化率;RT-PCR檢測(cè)成心肌樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)過后的兩種細(xì)胞中心臟發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4的表達(dá)情況;Western Blot檢測(cè)心肌細(xì)胞分化中晚期特異性蛋白cTnⅠ和CX43的表達(dá)情況;倒置

5、顯微鏡觀察SIS邊緣區(qū)域的兩種細(xì)胞是否有細(xì)胞搏動(dòng)現(xiàn)象。
　　結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)過程中從人骨髓和胎盤基蛻膜組織提取的MSCs均表達(dá)CD90、CD44、CD73和CD105，均不表達(dá)CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR，均表現(xiàn)出了成骨、成脂和成軟骨的多向分化潛能。BM-MSCs和PDB-MSCs在SIS中分別用5-aza進(jìn)行成心肌分化誘導(dǎo)培養(yǎng)4w后的SEM檢測(cè)結(jié)果顯示BM-MSCs和PDB-MSCs均與SIS具有良好的生物

6、相容性，誘導(dǎo)后的部分細(xì)胞出現(xiàn)了類似心肌細(xì)胞的星形或長(zhǎng)桿狀外形改變。免疫熒光染色顯示BM-MSCs和PDB-MSCs都產(chǎn)生了成心肌樣細(xì)胞分化，然而流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示兩種細(xì)胞的分化率沒有明顯差異。分化誘導(dǎo)后的兩種細(xì)胞都表達(dá)心臟發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4，心肌細(xì)胞分化中晚期特異性蛋白cTnⅠ和CX43。分化誘導(dǎo)過后兩種細(xì)胞之間的心臟發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4的表達(dá)量沒有顯著差異（P＞0.05）。然而，心肌細(xì)

7、胞分化中晚期特異性蛋白cTnⅠ和CX43在分化誘導(dǎo)后的PDB-MSCs中的表達(dá)量明顯高于其在分化誘導(dǎo)后的BM-MSCs中的表達(dá)量（P＜0.05）。同時(shí)，在倒置顯微鏡下并沒有觀察到SIS邊緣區(qū)域的BM-MSCs和PDB-MSCs在被誘導(dǎo)成為心肌樣細(xì)胞以后具有細(xì)胞搏動(dòng)現(xiàn)象。
　　結(jié)論: SIS是一種良好的心肌組織工程支架材料，它與BM-MSCs和PDB-MSCs之間具有良好的生物相容性。盡管BM-MSCs和PDB-MSCs在SIS三維