整合素α5β1的Lewisy結(jié)構(gòu)對其介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞粘附、轉(zhuǎn)移和耐藥的影響.pdf

1、前言：卵巢癌的病死率在婦科惡性腫瘤中居首位,目前其發(fā)生機(jī)理尚不清楚。近年來,糖復(fù)合物與腫瘤的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。糖復(fù)合物是細(xì)胞膜的重要組成部分,參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子粘附等作用,與細(xì)胞生長、凋亡、運(yùn)動、分化等生命過程密切相關(guān)。細(xì)胞癌變后細(xì)胞膜上的糖復(fù)合物,特別是其糖鏈部分發(fā)生結(jié)構(gòu)和量的變化。卵巢癌主要表現(xiàn)為Ⅱ型糖鏈的改變,如Lewisy抗原。研究表明75％的上皮性卵巢癌出現(xiàn)Lewisy不同程度的過量表達(dá),且增高的患者預(yù)后不良。
　　

2、Lewis抗原是腫瘤相關(guān)抗原,腫瘤標(biāo)記物CA125和MUC-1的分子結(jié)構(gòu)中均含有Lewisy結(jié)構(gòu)。Lewis抗原是細(xì)胞表面糖脂或糖蛋白上的糖類抗原,其最小組成單位是三糖,即半乳糖(Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和巖藻糖(Fuc),它們連接成Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAc(即Lewis a)或Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc(即Lewis x)。如上述兩種Lewis抗原中半乳糖的外側(cè)再接上另一個Fu

3、ca1,2,即分別為Lewis b或Lewisy。Lewis抗原合成的關(guān)鍵酶是巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase,FucT),催化GDP-Fuc的Fuc轉(zhuǎn)移至糖鏈中N-乙酰氨基乳糖殘基的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)上,并以α巖藻糖鍵相連接,其底物主要是糖蛋白的O-糖鏈、N-糖鏈、乳糖系或新乳糖系的糖脂。α巖藻糖轉(zhuǎn)移酶家族目前發(fā)現(xiàn)有9型,其中α1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶是合成Lewisy抗原的關(guān)鍵限速酶。
　　 我

4、們在前期工作中利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將人α1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT)基因轉(zhuǎn)入卵巢癌細(xì)胞系RMG-1,建立了Lewisy穩(wěn)定高表達(dá)卵巢癌細(xì)胞系RMG-1-hFUT,發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染后RMG-1-hFUT細(xì)胞惡性行為增強(qiáng)。我們推測Lewisy可能作為粘附分子的重要結(jié)構(gòu)參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,利用已經(jīng)建立的Lewisy穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞,探討L

5、ewisy與整合素α5β1的結(jié)構(gòu)關(guān)系,及對其介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞粘附、轉(zhuǎn)移和耐藥的影響,為研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定基礎(chǔ),為卵巢癌的早期診斷及靶器官治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 論文一:免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中Lewisy抗原和整合素α5/β1的表達(dá),并采用抗體進(jìn)行阻斷,再檢測其表達(dá)的變化;免疫沉淀檢測Lewisy與整合素α5/β1的關(guān)系。
　　 論文二:倒置顯微鏡觀察細(xì)胞在FN上的形態(tài)及

6、鋪展情況;Busk方法測定細(xì)胞粘附能力;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力;細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力;ELISA、Western blot和實(shí)時RT-PCR方法檢測基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中TIMP-1、TIMP-2,MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的表達(dá);采用抗體阻斷后再檢測各組細(xì)胞粘附轉(zhuǎn)移情況。
　　 論文三:建立FN介導(dǎo)的細(xì)胞粘附模型;MTT檢測細(xì)胞生長情況;FCM、熒光染色法和透射電鏡檢測各組細(xì)胞凋亡情況;免疫細(xì)胞化學(xué)、Wes

7、tern blot和實(shí)時PCR檢測各組細(xì)胞Bcl-2、Bcl-XL、FAK和p-FAK蛋白和基因的表達(dá)。采用不同抗體或抑制劑處理各組細(xì)胞再檢測細(xì)胞凋亡和相關(guān)分子表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 論文一:RMG-1-hFUT細(xì)胞中Lewisy抗原、整合素α5/β1的表達(dá)較RMG-1細(xì)胞增高,抗整合素α5、β1抗體阻斷后,Lewisy表達(dá)下降;抗Lewisy抗體阻斷后,整合素α5和β1的表達(dá)下降。免疫沉淀結(jié)果顯示整合素α5和β

8、1上有Lewisy,且RMG-1-hFUT中整合素α5和β1上總Lewisy的表達(dá)均較RMG-1增高。
　　 論文二:RMG-1-hFUT細(xì)胞鋪展、粘附和轉(zhuǎn)移能力明顯高于RMG-1,抗Lewisy抗體處理后下降。RMG-1-hFUT細(xì)胞TIMP-1和TIMP-2在基因和蛋白水平的表達(dá)均較RMG-1低,而MMP-2和MMP-9的表達(dá)增高,抗Lewisy抗體阻斷后,TIMP-1/2蛋白表達(dá)升高,而MMP-2/9下降。
　　

9、論文三:各組細(xì)胞的生長抑制率隨著卡鉑濃度的增加而升高,IC50由低到高依次為RMG-1組、FN-RMG-1組、RMG-1-hFUT組、FN-RMG-1-hFUT組。不同抗體或抑制劑處理后,各組IC50不同程度下降,其中抗Lewisy抗體最明顯?？ㄣK處理前,RMG-1-hFUT組中Bc1-2的表達(dá)較RMG-1組低、Bcl-XL和p-FAK較RMG-1組高、FAK無明顯差異;與FN粘附后,Bcl-2、Bcl-XL、FAK和p-FAK表達(dá)均增

10、高,且FN-RMG-1-hFUT組高于FN-RMG-1組?？ㄣK處理后,各組Bcl-2、Bcl-XL、FAK和p-FAK表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),抗Lewisy抗體阻斷后,其表達(dá)下降。
　　 結(jié)論：
　　 論文一:Lewisy是整合素α5β1結(jié)構(gòu)的一部分,α1,2-FT基因轉(zhuǎn)染使細(xì)胞整合素α5β1表達(dá)增加,且整合素α5β1亞基上Lewisy的表達(dá)也增加。
　　 論文二:Lewisy結(jié)構(gòu)增加整合素α5β1介導(dǎo)的細(xì)胞粘附、侵襲及