白藜蘆醇對WM239細(xì)胞的毒性作用及WM239與HUVEC共培養(yǎng)體系中N-cadherin磷酸化的影響.pdf

1、目的：
　　 黑色素瘤(melanoma)是惡性程度極高的一種腫瘤，占皮膚腫瘤死亡病例的絕大多數(shù)。主要發(fā)生于皮膚、粘膜和內(nèi)臟器官。黑色素瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高，預(yù)后較差，晚期易通過淋巴道及血液轉(zhuǎn)移。其發(fā)病率隨人種、地域、種族的不同有所差異。日光照射是黑色素瘤的主要誘因，其他誘發(fā)因素還包括家族史，惡性斑痣，較大的先天性黑素細(xì)胞痣和發(fā)育不良性痣綜合征。中國雖屬黑色素瘤的低發(fā)區(qū)，但近年來發(fā)病率卻呈不斷上升趨勢。
　　 惡性黑素瘤

2、擴散迅速，可在診斷數(shù)月后死亡。目前外科手術(shù)切除是治療黑色素瘤的常用方法，早期5年治愈率可達100％。因此早診斷，早治療是黑色素瘤預(yù)后的關(guān)鍵。惡性黑色素瘤對放化療不敏感，而傳統(tǒng)的中藥在抗黑色素瘤轉(zhuǎn)移治療方面展示了良好的應(yīng)用潛能。
　　 白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，主要存在于葡萄果皮中。近年來它的抗癌作用已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。許多研究已經(jīng)證實，白藜蘆醇具有廣泛的生物學(xué)活性，包括神經(jīng)保護作用、抗癌、誘導(dǎo)凋亡等作用。白藜蘆醇已被確定

3、為化學(xué)防癌藥，能夠有效地抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展。體外實驗發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠抑制B16M細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，從而抑制B16M細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移。本研究主要探討黑色素瘤細(xì)胞穿越內(nèi)皮單層過程中白藜蘆醇對其表面某些粘附分子表達水平的影響。
　　 方法和結(jié)果：
　　 1.白藜蘆醇對WM239細(xì)胞的毒性作用
　　 1.1、MTT法檢測白藜蘆醇對WM239細(xì)胞增殖的影響
　　 12.5～200μmol/L的白藜蘆醇作用于W

4、M239細(xì)胞48h和72h后，對其增殖具有一定的抑制作用，作用72h時，濃度在50μmol/L以上其抑制率高于50％，且抑制程度與藥物濃度呈正相關(guān)。
　　 1.2、流式細(xì)胞術(shù)檢測白藜蘆醇對WM239細(xì)胞周期及凋亡的影響
　　 其中0、25、50和100μmol/L藥物與WM239細(xì)胞作用48h后，凋亡率分別為0.1％、9.7％、8.9％和19.3％，處理組與未處理組相比細(xì)胞凋亡明顯增加，G0/G1期細(xì)胞分別為7l.9％、

5、77.3％、81.0％和83.7％，S期分別為21.5％、17.8％、16.0％和14.6％，G2/M期為6.5％、4.8％、2.9％和1.8％，細(xì)胞周期阻滯于G1期，S期和G2期細(xì)胞比例下降，劑量依賴關(guān)系明顯。
　　 2.白藜蘆醇對WM239遷移的抑制作用
　　 2.1、MTT法篩選合適的白藜蘆醇濃度
　　 應(yīng)用MTT法檢測白藜蘆醇對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和黑色素瘤細(xì)胞(WM239)的毒性作用，以確定實驗

6、所需的藥物濃度和相應(yīng)的時間點。結(jié)果表明白藜蘆醇濃度小于25μmol/L時,48小時內(nèi)對兩種細(xì)胞的毒性作用較弱，隨著時間的延長和藥物濃度的增加，白藜蘆醇對兩種細(xì)胞的毒性作用逐漸增強。
　　 2.2、RT-PCR檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達
　　 應(yīng)用RT-PCR檢測白藜蘆醇的不同藥物濃度作用于WM239細(xì)胞后基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達的情況。結(jié)果表明隨著藥物濃度的逐漸升高MMP-9的表達成下降的趨勢

7、。
　　 2.3、白藜蘆醇對WM239細(xì)胞遷移能力的影響
　　 應(yīng)用Transwell小室法檢測不同濃度的白藜蘆醇對黑色素瘤遷移能力的影響。結(jié)果表明，白藜蘆醇能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移能力。并且隨著藥物濃度的逐漸增加，WM239細(xì)胞的遷移能力逐漸減弱。
　　 3.白藜蘆醇對WM239與HUVEC共培養(yǎng)體系N-cadherin磷酸化的影響
　　 3.1、白藜蘆醇對WM239和HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)體系中N-c

8、adherin表達的影響
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測WM239細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)體系中N-cadherin表達的情況。結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加N-cadherin表達基本沒有變化，這說明，白藜蘆醇有可能不是通過抑制N-cadherin表達來干涉WM239細(xì)胞轉(zhuǎn)移的。
　　 3.2、白藜蘆醇對WM239和HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)體系中N-cadherin胞內(nèi)段磷酸化及與p-catenin結(jié)合情況的影響
　　

9、應(yīng)用westemblot檢測WM239和HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)體系中N-cadherin胞內(nèi)段磷酸化及與p-catenin結(jié)合的情況。實驗結(jié)果表明，N-cadherin胞內(nèi)段磷酸化的量隨著白藜蘆醇藥物濃度的升高而逐漸降低，N-cadherin胞內(nèi)結(jié)合的p-catenin隨著藥物濃度的升高逐漸升高。
　　 3.3、白藜蘆醇對Src活化的影響
　　 應(yīng)用westernblot檢測WM239和HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)體系中Src活化

10、的情況。實驗結(jié)果表明，隨著白藜蘆醇藥物濃度的逐漸升高，P-Src表達量逐漸降低。
　　 結(jié)論：
　　 本研究通過建立黑色素瘤細(xì)胞穿越內(nèi)皮單層的體外模型。探討了白藜蘆醇抑制黑色素瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制。結(jié)果表明，白藜蘆醇可以抑制黑色素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力，并且藥物濃度與抑制率呈正相關(guān)。白藜蘆醇對共培養(yǎng)體系細(xì)胞表面粘附分子N-cadherin的表達影響較小，它主要是通過抑制Src的活化，降低了N-cadherin胞內(nèi)段磷酸化，致使游離