煙草根系鉀通道基因NTORK1的功能及調(diào)控研究.pdf

1、為研究煙草鉀通道基因NTORK1是否受激素調(diào)控，參與調(diào)節(jié)根系的鉀外流，利用pBI121和pER8（含XVE系統(tǒng)）為骨架載體，分別構(gòu)建了NTORK1啟動子驅(qū)動GUS的表達載體和受ES誘導啟動NTORK1的RNAi表達載體。通過農(nóng)桿菌介導瞬時轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，分別研究了NTORK1啟動子和NTORK1基因的功能。獲得的結(jié)果如下：
　　1、使用不同濃度 SA和 NAA處理低鉀 Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)的煙草 K326植株，然后檢測植

2、株根外鉀離子含量變化，同時使用Real-time PCR分析NTORK1基因的表達量。結(jié)果顯示，50μmol/L SA能抑制根鉀離子外流；500μmol/L SA能誘導根鉀離子外流，并誘導NTORK1基因的表達。
　　2、構(gòu)建了 NTORK-GUS表達載體。以 pBI121載體為基礎，克隆 NTORK1基因上游2111bp片段替換原載體上的35S啟動子。構(gòu)建了NTORK1啟動子驅(qū)動的GUS基因表達載體pBI121-NTORK。

3、r>　　3、通過煙葉瞬時轉(zhuǎn)化pBI121-NTORK表達載體和不同激素處理。結(jié)果顯示， NTORK啟動子受5.4μmol/LNAA和500μmol/LSA的誘導表達。
　　4、構(gòu)建了NTORK1的RNAi表達載體。以pER8載體為基礎，在多克隆位點插入NTORK1基因的RNAi片段、Tnos終止子、DR5啟動子和GUS。其中RNAi片段來自NTORK1基因3’端250bp片段和actin內(nèi)含子。
　　5、通過葉盤穩(wěn)定轉(zhuǎn)化NT

4、ORK1的RNAi表達載體，獲得大量潮霉素抗性苗。經(jīng)PCR鑒定獲得多株轉(zhuǎn)基因陽性苗。使用5μmol/L17-β-雌二醇（Es）誘導轉(zhuǎn)基因植株，Real-time PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草NTORK1的表達被抑制，抑制率最高達到90％。
　　6、使用含5μmol/L17-β-雌二醇的低鉀Hoagland培養(yǎng)液對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草水培3d。然后在分別含5μmol/L Es、5μmol/L Es+50μmol/L SA、5μmol/L

5、 Es+500μmol/L SA的無鉀Hoagland培養(yǎng)液中各處理40min。通過檢測培養(yǎng)液的鉀離子濃度，以及葉片NTORK1基因的表達量。結(jié)果顯示，在Es+500μmol/L SA培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株的NTORK1表達量比在Es+50μmol/L SA處理中增加，同時轉(zhuǎn)基因植株的培養(yǎng)液鉀離子含量明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株。以上說明， NTORK1受SA調(diào)控，介導煙草根系的鉀離子外流，500μmol/L的SA能誘導NTORK1表達