SOST基因—9247 T-C多態(tài)的功能及表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、SOST基因(sclerostin，SOST)位于人類基因組的17q12-21，主要在骨細(xì)胞中表達(dá)，含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，編碼硬化蛋白。硬化蛋白是一種糖蛋白，是骨形成的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)者，SOST基因敲除的小鼠骨密度顯著增加。SOST基因突變引起以骨密度增加為特征的硬縮癥Van Buchem和鞏膜固化(Sclerosteosis)，Dutch VanBuchem則是SOST基因下游35kb處一個(gè)52kb的缺失引起的。
　　 我們

2、先前發(fā)現(xiàn)SOST基因-9247的順式調(diào)節(jié)多態(tài)性T/C(rs1230399)與骨密度顯著關(guān)聯(lián)。計(jì)算分析表明rs1230399位于兩個(gè)協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子FOXA1和C/EBPα的中心識(shí)別區(qū)域。T/C多態(tài)影響FOXA1和C/EBPα與SOST基因DNA序列的結(jié)合，這個(gè)生物信息學(xué)的分析結(jié)果需要用實(shí)驗(yàn)的方法加以證明。
　　 研究DNA與蛋白質(zhì)互作的方法主要有凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(Electrophoreticmobility shift assa

3、y，EMSA)、染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，CHIP)實(shí)驗(yàn)和反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)等實(shí)驗(yàn)方法。本研究的目的就是通過(guò)EMSA、CHIP實(shí)驗(yàn)證明SNP位點(diǎn)rs1230399 T/C多態(tài)對(duì)SOST基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子FOXA1結(jié)合的影響。本研究結(jié)果將對(duì)全面理解rs1230399T/C多態(tài)的功能和

4、SOST基因的表達(dá)調(diào)控有重要意義，也為揭示骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。
　　 人骨肉瘤SAOS-2細(xì)胞是研究SOST基因表達(dá)的一個(gè)比較好的細(xì)胞系，本研究以SAOS-2細(xì)胞為材料，先以Western Blot方法確定該細(xì)胞中有FOXA1蛋白的表達(dá)，再分別通過(guò)細(xì)胞外實(shí)驗(yàn)EMSA和細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)CHIP兩個(gè)方法來(lái)研究rs1230399 T/C多態(tài)對(duì)SOST基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子FOXA1結(jié)合的影響。
　　 通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，E

5、MSA結(jié)果顯示我們所設(shè)計(jì)的含有T/C的探針?biāo)Y(jié)合的蛋白不是我們預(yù)期的FOXA1蛋白，T/C與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合都沒(méi)有明顯差異，在進(jìn)一步用CHIP實(shí)驗(yàn)重復(fù)時(shí)也沒(méi)有得到與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列片段。
　　 通過(guò)RT-PCR方法研究SOST基因的本底表達(dá)，經(jīng)過(guò)多次引物設(shè)計(jì)摸索中擴(kuò)增出了SOST基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SOST基因在SAOS-2細(xì)胞中表達(dá)量偏低。用10μM和1μM雌激素處理24h后，SOST基因和FOXA1基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量都