ChIFN-γ調(diào)控?zé)煵菹倜l(fā)育基因功能研究.pdf

1、雞γ干擾素（Chicken interferon-gamma，ChIFN-γ）作為一種細(xì)胞因子，不僅具有廣譜的高抗病毒活性，還起著抗細(xì)菌與抗寄生蟲的作用，ChIFN-γ的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制在動物體內(nèi)已比較清楚。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn) ChIFN-γ能顯著提高煙草的抗蟲性。轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草的腺毛密度增加了一倍，腺毛分泌物較野生煙草明顯增多，推測這些性狀提高了煙草抗蟲性。通過檢測轉(zhuǎn) ChIFN-γ煙草和野生型煙草的全基因組差異表達(dá)譜，結(jié)合

2、GO與KEGG Pathway分析篩選出7個抗蟲候選基因，進(jìn)行熒光定量PCR驗證最終獲得3個可能與煙草腺毛發(fā)育相關(guān)的基因：CyP71、LBM1和IspH。本研究主要以3個基因的功能為重點，通過基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行基因過表達(dá)研究，研究結(jié)果如下：
　　通過提取煙草根和葉總RNA，一步法RT-PCR克隆了CyP71、LBM1和IspH。其中CyP71序列全長1545 bp，開放閱讀框1545 bp，編碼514個氨基酸，以亮氨酸含

3、量最高（11.9％），生物信息學(xué)推測蛋白質(zhì)性質(zhì)：分子量為58.11 kDa，pI為8.49，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為38.04，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)，無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域存在。已登錄到NCBI的其他物種的CyP71基因中，與馬鈴薯（Solanum tuberosum）的同源性達(dá)最高，達(dá)88%以上，系聚類分析表明CyP71在進(jìn)化過程中相對保守。
　　LBM1序列全長846 bp，開放閱讀框846 bp，編碼281個氨基酸，絲氨酸含量最高（9.6

4、%），推測蛋白質(zhì)性質(zhì)：分子量31.98 kDa，pI為5.08，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)48.07，屬于不穩(wěn)定蛋白，未匹配到信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)LBM屬于MYB類轉(zhuǎn)錄因子并存在一個蛋白-蛋白互作的SANT DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。
　　IspH序列長1386 bp，開放閱讀框1386 bp，編碼461個氨基酸，谷氨酸和賴氨酸含量最高分別為8.7%和8.5%，分子量51.66 kDa，預(yù)測pI為5.59，蛋白質(zhì)穩(wěn)定系數(shù)29.

5、02，屬于穩(wěn)定蛋白，推測存在線粒體和葉綠體的靶向信號肽。氨基酸序列在茄科植物中高度保守，與馬鈴薯和番茄的同源性都在92%以上，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明IspH屬于LytB超家族，這類家族蛋白負(fù)責(zé)催化MEP途徑的最后一步反應(yīng)。
　　構(gòu)建含植物過表達(dá)載體pSH737-IspH、pSH737-CyP71和pSH737-LBM的農(nóng)桿菌LBA4404，通過蘸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，果莢成熟后收集種子進(jìn)行篩選，得到CyP71抗性植株38株，LBM

6、135株，IspH30株，3個基因的轉(zhuǎn)化率均在5%以上，其中對IspH抗性植株隨機(jī)抽取10株進(jìn)行GUS染色和基因組PCR驗證，結(jié)果均為陽性。轉(zhuǎn)IspH植株長勢較同時期的野生型稍好，葉片顏色較深，GUS染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)IspH擬南芥葉片所有的表皮毛細(xì)胞GUS報告基因都能被啟動表達(dá)。體視顯微鏡下觀測，表皮毛細(xì)胞均呈藍(lán)色，表明IspH基因與表皮毛的發(fā)育直接相關(guān)。轉(zhuǎn)IspH擬南芥表皮毛與野生型的大小和分布無顯著差異，但數(shù)量較多。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，2