烏司他丁對GalN-LPS所致大鼠暴發(fā)性肝衰竭的治療作用及其機制研究.pdf

1、背景和目的： 暴發(fā)性肝衰竭(fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF)是肝細胞大面積壞死所引起的肝功能嚴重障礙綜合征，其病情兇險而復雜、并發(fā)癥多、預后差、病死率高，目前尚無理想的藥物。雖然肝移植術可明顯改善FHF的預后，但是由于健康供體肝短缺及其昂貴的價格，難以滿足臨床需要。生物型人工肝與肝細胞移植是近年肝衰竭治療的研究熱點，但免疫排斥是其發(fā)展瓶頸。 烏司他丁(Ulinastatin，UTI)是從人體尿

2、液中提取的絲氨酸蛋白酶抑制劑，它在肝臟中合成，具有廣譜抑酶、抗炎、抗休克、抑制氧化應激的作用。目前已經(jīng)廣泛用于治療急性胰腺炎、彌散性血管內(nèi)凝血，抗休克、手術侵襲等[1]。暴發(fā)性肝衰竭病人血液內(nèi)UTI水平明顯降低，急性肝炎病人的血液UTI水平代償性升高；在肝臟異?；謴秃?，急性重型肝炎的血液UTI水平就逐漸升高，而急性肝炎病人升高的血液UTI水平也逐漸降至正常[2]，因而可以認為FHF病人血液內(nèi)UTI水平與其發(fā)展和預后相關。本實驗即是通過補

3、充FHF模型大鼠體內(nèi)烏司他丁含量，研究其治療大鼠FHF的作用，探討其作用機制。 方法： 一、大鼠分組和模型的建立健康雄性Sprague-Dawley系大鼠186只，體重200～250g，隨機分為對照組(A組6只)，模型組(B組)和UTI處理組(C組)，B、C組再分為6h、12h、24h、36h、48h5個亞組，每個亞組15只；另外B、C組各留15只，觀察其生存率。B組和C組采用腹腔注射D-GalN(800 mg/kg)，

4、LPS(40μg/kg)構建大鼠暴發(fā)性肝衰竭模型，C組造模后30 min腹腔內(nèi)注射UTI1×105U/kg，B組腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水，A組則腹腔注射2ml生理鹽水。在相應時間點處死各組大鼠，10％水合氯醛0.35 ml/kg麻醉，經(jīng)門靜脈采血，取出肝組織立即置于用中性福爾馬林固定12h，脫水、石蠟包埋，另取部分肝組織立即液氮凍存。全自動生化儀檢測大鼠血液生化指標，肝組織切片HE染色觀察肝臟病理形態(tài)學變化。 二、檢測早期炎癥指標

5、ELISA法檢測血液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測肝臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-6分子水平的表達，比色法測定肝臟髓過氧化物酶(Myelo-peroxidase，MPO)活性，硝酸還原酶法檢測血清NO含量； 檢測晚期炎癥指標HMGB1肝臟含量用免疫組化法(Envision二步法)觀察HMGB1在鼠肝臟內(nèi)的表達，比較HMGB1在A、B、C組中的分布差異，分析應用U

6、TI對肝組織中的HMGB1含量的影響，并用RT-PCR法檢測和分析各組肝臟組織中HMGB1分子水平表達差異，分析其機制。 結果： 1、B組大鼠存活率為40％，生化指標明顯升高，24h達到最高峰ALT為8346.7±1363.1； AST為9766.7±1274.1。肝病理學表現(xiàn)為肝小葉結構被破壞，肝細胞空泡變性、腫脹，可見不同程度的細胞凋亡及壞死，小葉內(nèi)及匯管區(qū)有大量炎性細胞浸潤，F(xiàn)HF動物模型成功建立；與之相比，C組大

7、鼠的存活率為66.7％(P<0.05)，生化指標明顯好轉(zhuǎn)，24h時ALT4151.3±970.0(P<0.01)，AST4696.7±1476.9(P<0.01)；病理切片顯示肝臟損傷情況減輕； 2、實驗結果顯示B組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均在6h為最高，分別為396.24±121.8 pg/ml，226.40±41.25 pg/ml，232.49±23.07 pg/ml，隨后很快下降，24 h基本降至正常水

8、平；較之于B組，C組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-66h時分別為198.64±32.72 pg/ml(p<0.01)，117.03±21.2pg/ml(p<0.01)，146.39±16.74pg/ml(p<0.01)；肝臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達水平也在6h時為最高峰，隨后逐漸降低，至48h仍維持較高水平。各組大鼠血清NO水平在6h為最高值，B、C組6h NO水平分別為235±105.3μmol·

9、L-1、192.5±78.1μmol·L-1(P<0.05)；肝臟MPO活性24h升至最高，B、C組大鼠肝臟MPO活性分別為23.1±10.6μmol·g-1，17.5±7.4μmol·g-1(P<0.05)。 晚期炎性因子HMGB1組化結果顯示，在正常肝組織中，部分肝實質(zhì)細胞和巨噬細胞核內(nèi)有少量HMGB1表達，B組大鼠肝臟HMGB1表達明顯，并出現(xiàn)核外表達情況，以中央靜脈周圍和匯管區(qū)及壞死區(qū)周圍表達最為明顯。C組大鼠HMGB1

10、表達陽性細胞數(shù)較B組明顯減少(p<0.05)，且分布尚均勻，無明顯細胞漿內(nèi)、細胞外表達；RT-PCR檢測C組實驗動物肝組織HMGB1 mRNA水平也明顯低于B組動物的水平(p<0.05)。 結論： 1、UTI能明顯改善大鼠FHF肝臟生化指標，減輕肝臟病理改變，增加大鼠存活率； 2、TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子是在肝臟炎癥起始階段分泌并發(fā)揮作用，他們的分泌和肝臟組織損傷情況并不同步。肝細胞、組織損傷是

11、由于TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子誘導的細胞凋亡、下游細胞因子的激活以及炎性細胞趨化聚集所致。UTI的應用可以減少TNF-α等促炎因子的分泌，減輕NO炎癥損傷，減少肝臟組織的炎性細胞浸潤；HMGB1是FHF晚期出現(xiàn)的炎癥因子，其持續(xù)時間較長，且HMGB1增強表達和主動釋放與血清ALT水平及肝臟損傷程度相一致，因而HMGB1在FHF肝損傷進展中必定發(fā)揮重要作用，有可能成為臨床治療FHF重要靶點。UTI有效降低FHF大鼠肝臟HM