動脈粥樣硬化過程中D-dimer和Nogo-B對巨噬細胞功能的影響.pdf

1、研究背景：動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性的炎癥反應，單核巨噬細胞在該病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用：AS初期，單核細胞粘附于受損內皮細胞表面并遷移到內膜下分化為巨噬細胞，后者吞噬脂質形成泡沫細胞；泡沫細胞通過分泌促炎因子誘導斑塊區(qū)的炎癥反應進一步發(fā)生；AS后期，泡沫細胞壞死導致胞外脂質堆積形成壞死核心；而巨噬細胞分泌的基質金屬蛋白酶也與斑塊不穩(wěn)定性相關。凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（Lectin-like

2、 oxLDL receptor-1，LOX-1）在參與AS的細胞表面均有表達：LOX-1介導氧化低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，oxLDL）引發(fā)的內皮損傷及粘附分子表達，促進單核巨噬細胞與內皮的粘附，脂質的攝取及泡沫細胞的形成。許多病理因素可通過上調LOX-1的表達參與AS的發(fā)展。D-dimer是纖維蛋白降解產物，目前作為一個獨立的臨床指標用于疚病的診斷。血漿D-dimer水平可以指示AS

3、的嚴重程度?；蛐酒Y果顯示，D-dimer可上調巨噬細胞LOX-1表達，提示D-dimer可能參與AS。Nogo-B蛋白在血管重構過程中發(fā)揮引人注目的作用，也有研究表明該蛋白與AS相關。
　　 目的：研究D-dimer對巨噬細胞oxLDL受體LOX-1的表達，巨噬源性泡沫細胞的形成及其功能的影響。Nogo-B在巨噬源性泡沫細胞中的表達變化及其對泡沫細胞功能的影響。
　　 方法和結果：
　　 1.用D-dimer

4、處理RAW264.7細胞，收集不同時間點的細胞提取總RNA及總蛋白，分別用Realtime PCR和Western blot方法測定樣品中LOX-1 mRNA和蛋白表達。結果顯示D-dimer對LOX-1的誘導作用呈時間依賴性，刺激12h后mRNA表達即上調，最大效應出現(xiàn)在24～36h，48h以后誘導作用減弱。LOX-1蛋白的表達則在24～48h最為明顯。用不同濃度D-dimer與RAW264.7細胞共孵育，再測定LOX-1 mRNA和

5、蛋白表達。結果顯示D-dimer對LOX-1的誘導作用呈劑量依賴性，1μg/mL D-dimer即可誘導LOX-1的表達
　　 2.分別用D-dimer（2μg/mL），oxLDL（10μg/mL）與巨噬細胞共孵育48小時，然后用Western blot檢測細胞中CD36的表達，結果顯示該濃度的D-dimer不能上調CD36蛋白的表達，oxLDL也不能促使CD36表達顯著升高。但將細胞先用相同濃度的D-dimer處理24h后再用

6、oxLDL（10μg/mL）孵育24h，Western blot結果顯示CD36蛋白表達較陰性對照組及oxLDL處理組均顯著升高。
　　 3.D-dimer孵育巨噬細胞24h后用LOX-1的抗體封閉細胞表面受體，再用Dil-oxLDL刺激細胞，觀察各紐細胞熒光強度差異。結果顯示，D-dimer處理組細胞的熒光強度與未處理組相比明顯增強，而用LOX-1抗體處理細胞后，熒光強度下降。提示D-dimer可能通過誘導LOX-1表達促進巨

7、噬細胞吞噬oxLDL，用oxLDL刺激預先用D-dimer處理過細胞，用Realtime PCR檢測炎癥因子TNF-α和IL-6的表達。結果顯示：D-dimer可以增強oxLDL對炎癥因子的誘導作用。
　　 4.D-dimel孵育巨噬細胞24h，Western blot檢測細胞內組成型PKC蛋白的表達，結果顯示D-dimer可增加該蛋白的表達。用PKC抑制劑預處理巨噬細胞，再用D-dimer孵育，Western blot檢測細胞

8、LOX-1蛋白的表達，結果表明用PKC抑制劑處理后，D-dimer對LOX-1表達的誘導作用減弱。
　　 5.用不同濃度DiI-oxLDL誘導巨噬細胞吞噬脂質形成泡沫細胞，以熒光強度指示脂質吞噬量。48h后將細胞裂解，Western blot檢測泡沫細胞中Nogo-B的表達。各組熒光強度表明巨噬細胞對脂質的吞噬量與細胞外DiI-oxLDL濃度呈正比，Westernblot結果顯示泡沫細胞中Nogo-B蛋白表達增多，且低濃度oxL

9、DL（≤10μg/mL）不能誘導Nogo-B蛋白的表達。
　　 6.Nogo-B的siRNA轉染Raw264.7細胞，48h后檢測細胞中Nogo-B蛋白的表達，結果顯示siRNA可以有效降低巨噬細胞中Nogo-B蛋白的表達，沉默效率可達70％以上。用oxLDL刺激轉染siRNA的巨噬細胞，Realtime PCR檢測細胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6的表達，結果顯示：減少Nogo-B蛋白表達可以使泡沫細胞表達更多的促炎因子