亮氨酸對(duì)胰島β細(xì)胞的作用及機(jī)制研究：(AMPK)-(PDX-1)-(GCK-GLUT2).pdf

1、研究背景： 我們的實(shí)驗(yàn)旨在研究長(zhǎng)期高濃度亮氨酸培養(yǎng)對(duì)葡萄糖刺激的胰島素釋放和胰島素含量的影響，并且進(jìn)一步研究其相關(guān)機(jī)制。 目的： 本研究利用體外培養(yǎng)的大鼠胰島β細(xì)胞株在RPMI1640培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)。不同類型的胰島β細(xì)胞株以不同劑量亮氨酸為處理因素，以AICAR為AMPK激動(dòng)劑，Compound C為AMPK阻斷劑，對(duì)以下問題進(jìn)行探討： 1．觀察長(zhǎng)期不同濃度亮氨酸培養(yǎng)對(duì)葡萄糖刺激的胰島素釋放功能和胰島素

2、含量的影響。 2．觀察長(zhǎng)期高濃度亮氨酸對(duì)AMPK、PDX-1、GCK/GLUT2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討可能的機(jī)制。 3．探討在胰島β細(xì)胞中，AMPK與PDX-1，GCK/GLUT2的關(guān)系。 4．探討在胰島β細(xì)胞中，AMPK是否通過PDX-1影響GCK/GLUT2。 5．觀察長(zhǎng)期高濃度亮氨酸是否通過通路影響高糖刺激的胰島素釋放以及胰島素含量。 6．在大鼠INS-1細(xì)胞中檢測(cè)長(zhǎng)期亮氨酸培養(yǎng)2

3、4h對(duì)胰島素釋放，胰島素含量，PDX-1以及其下游因子GLUT2蛋白的表達(dá)，并且探討亮氨酸在抑制高糖刺激的胰島素釋放后，去除亮氨酸這個(gè)環(huán)境條件，是否能夠再恢復(fù)。 方法： 1．INS-1和RIN m5F胰島細(xì)胞株的培養(yǎng)和分組：INS-1與RIN m5F細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)分為六組：C組，正常對(duì)照組；L組，40mM亮氨酸組；A組，0．5 mMAICAR；C組，10μM Compound C；LA組，L

4、與A共培養(yǎng)； PC組，P與C共培養(yǎng)。處理時(shí)間：48小時(shí)。 2．INS-1，RIN m5F，DN-PDX-1＃28和PDX-1＃6細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素釋放功能以及胰島素含量的測(cè)定與評(píng)價(jià)：INS-1和RIN m5F細(xì)胞種于24孔板中，分組處理后，在葡萄糖濃度為3μM、27．8 mM的KRB緩沖液分別孵育20min，收集上清，放射免疫方法測(cè)定分泌的胰島素水平分別為基礎(chǔ)胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌。 3．細(xì)胞活力的檢測(cè)：

5、胰島細(xì)胞株分組培養(yǎng)后，使用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞毒性。 4．AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2的檢測(cè)：在INS-1，RIN m5F細(xì)胞上，Real-timePCR檢測(cè)NdPK、PDX-1、GCK、GLUT2mRNA的表達(dá)；Western blotting檢測(cè)AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2蛋白表達(dá)。 5．RPMI1640培養(yǎng)PDX-1＃6細(xì)胞株與PDX-1不表達(dá)的PDX-1＃28細(xì)胞，加以強(qiáng)力霉素，使PDX

6、-1過表達(dá)以及不表達(dá)， RT-PCR檢測(cè)AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2 mRNA表達(dá)的變化：Western blotting檢測(cè)AMPK、PDX-1、GCK、GLUT2蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1．在INS-1與RIN m5F細(xì)胞中AICAR與Compound C的作用 與正常組相比，AICAR活化后降低INS-1細(xì)胞中高糖刺激的胰島素釋放29％并且降低細(xì)胞內(nèi)胰島素含量30％；在RIN m5F細(xì)胞中，AICA

7、R活化后降低細(xì)胞內(nèi)胰島素含量降低34％。當(dāng)AMPK被Compound C抑制后，則起到相反的作用。與正常組相比，Compound C能夠增加INS-1細(xì)胞高糖刺激的胰島素釋放17％和INS-1細(xì)胞內(nèi)胰島素含量19％以及RIN m5F細(xì)胞25％。但是，無(wú)論是AICAR或者Compound C均不能影響INS-1細(xì)胞低糖刺激的基礎(chǔ)胰島素釋放。 2．在DN-PDX-1＃28細(xì)胞中AICAR與Compound C的作用 在未用強(qiáng)

8、力霉素誘導(dǎo)的條件下，PDX-1蛋白表達(dá)均很強(qiáng)，并且POX-1蛋白表達(dá)在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)24 h，48 h或者72 h沒有顯著差異。在500ng/ml強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)條件下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，PDX-1蛋白表達(dá)越來(lái)越弱，更近一步來(lái)說(shuō)，最弱的條帶出現(xiàn)在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)72小時(shí)組。與上述結(jié)果相對(duì)應(yīng)，GLUT2與GCK與POX-1一樣有相似的結(jié)果。在未用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的條件下，無(wú)論是24 h，48 h或者72 h，GCK與GLUT2蛋白表達(dá)均沒有顯著差異．在50

9、0 ng/ml強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)24 h，48 h或者72 h條件下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，GCK與GLUT2蛋白表達(dá)越來(lái)越弱。 3．不同濃度氨基酸在INS-1與RIN m5F細(xì)胞對(duì)胰島素分泌的影響 結(jié)果顯示，當(dāng)INS-1與RIN m5F細(xì)胞在不同濃度的亮氨酸中培育48h后，亮氨酸以劑量依賴方式抑制高糖刺激的胰島素釋放以及含量。與正常對(duì)照組相比，40 mM亮氨酸顯著降低高糖刺激的胰島素釋放34％，并且顯著降低胰島素含量24％；但是對(duì)于

10、低糖刺激的胰島素釋放沒有顯著影響。與正常對(duì)照組相比，10 mM或者20 mM亮氨酸不能顯著影響胰島素釋放和胰島素含量在INS-1中。RIN m5F細(xì)胞所呈現(xiàn)的趨勢(shì)與INS-1細(xì)胞一樣，與正常對(duì)照組相比，40 mM亮氨酸顯著降低胰島素含量24％。Western blotting，real-time PCR方法被用來(lái)檢測(cè)p-AMPK，PDX-1，GCK GLUT2。與正常對(duì)照組相比，40 mM亮氨酸顯著增強(qiáng)p-AMPK蛋白表達(dá)在INS-1細(xì)

11、胞中和RIN m5F細(xì)胞中。 4．亮氨酸在胰島β細(xì)胞株中毒性檢測(cè) 結(jié)果顯示，在INS-1，RIN m5F，DN-PDX-1＃28和PDX-1＃6 cells中，與正常組相比，10 mM亮氨酸培養(yǎng)的細(xì)胞活力分別為99％，97％，98％，98％，20mM亮氨酸培養(yǎng)的細(xì)胞活力分別為98％，97％，98％，99％，40 mM亮氨酸培養(yǎng)的細(xì)胞活力分別為97％，97％，96％，95％。這些結(jié)果證明無(wú)論是10，20或者40 mM亮氨酸

12、對(duì)胰島β細(xì)胞均沒有細(xì)胞毒性作用。 5．AICAR或者Compound C在長(zhǎng)期亮氨酸培養(yǎng)條件下對(duì)INS-1和RIN mSF細(xì)胞的作用 在INS-1和RIN m5F細(xì)胞中，單純亮氨酸組，單純AICAR組或者單純Compound C組產(chǎn)生與Fig．1或者Fig．4相似的結(jié)果。此外，與單純亮氨酸組相比，亮氨酸與 AICAR共同培養(yǎng)組顯著降低高糖刺激的胰島素釋放21％在INS-1中，降低細(xì)胞內(nèi)胰島素含量23％在INS-1中，an

13、d26％在RIN m5F cells中。更進(jìn)一步，長(zhǎng)期亮氨酸培養(yǎng)后引起高糖刺激的胰島素釋放和胰島素含量降低，亮氨酸與Compound C共同培養(yǎng)可以顯著恢復(fù)降低的高糖刺激的胰島素釋放和胰島素含量。與單純亮氨酸組相比，亮氨酸與Compound C共同培養(yǎng)顯著增加高糖刺激的胰島素釋放33％在INS-1細(xì)胞中，增加胰島素含量24％在INS-1細(xì)胞中，29％在RIN m5F中。 6．不同濃度亮氨酸對(duì)胰島素釋放、胰島素含量、以及胰島β細(xì)胞

14、蛋白的影響 我們的研究結(jié)果顯示不同濃度的氨基酸培養(yǎng)24小時(shí)以劑量依賴形式抑制高糖高糖刺激的胰島素釋放以及胰島素含量，40mmol/l亮氨酸引起的作用最明顯。與正常組相比，40mmol/l亮氨酸顯著抑制高糖刺激的胰島素釋放11％，胰島素含量14％，但是對(duì)低糖刺激的胰島素釋放沒有顯著作用。 7．24h恢復(fù)后對(duì)胰島素釋放、含量以及胰島β細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示與正常組相比，40 mmol/l亮氨酸培養(yǎng)24 h顯著降

15、低高糖刺激的胰島素釋放11％（P=0．026）和胰島素含量14％（P=0．008），并且40 mmol/l亮氨酸培養(yǎng)48 h顯著降低高糖刺激的胰島素釋放22％（P=0．003）和胰島素含量20％（P=0．002）。當(dāng)亮氨酸預(yù)培養(yǎng)24h后再去除亮氨酸在普通培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24h，與那些在亮氨酸培養(yǎng)基中培樣24 h或者48 h，高糖刺激的胰島素釋放升高13％（P=0．032）或者27％（P=0．002），胰島素含量升高10％（P=0．014

16、）或者20％（P=0．003）。與正常組相比，亮氨酸培養(yǎng)降低PDX-1和GLUT2蛋白表達(dá)，亮氨酸培樣48 h組最明顯。亮氨酸培養(yǎng)24 h后降低的PDX-1和GLUT2蛋白表達(dá)在去除亮氨酸后繼續(xù)培養(yǎng)24h后可以基本恢復(fù)到正常（P=0．013；P=0．015）。與亮氨酸培養(yǎng)48h組相比，經(jīng)過24h恢復(fù)培養(yǎng)后的PDX-1和GLUT2蛋白條帶顯著增強(qiáng)（P=0．005；P=0．006）。 結(jié)論： 1．理下的胰島細(xì)胞株中，AMPK

17、可以調(diào)節(jié)GCK/GLUT2的表達(dá)，并且這種調(diào)節(jié)可能是通過PDX-1發(fā)揮作用的。 2．氨基酸環(huán)境，同樣存在著AMPK通過PD-1調(diào)節(jié)GCK/GLUT2． 3．長(zhǎng)期高濃度亮氨酸培養(yǎng)可以活化AMPK，然后降調(diào)PDX-1以及其下游因子GCK與GLUT2 mRNA和蛋白的表達(dá)，最終抑制高糖刺激的胰島素釋放以及胰島素含量。 4．亮氨酸培養(yǎng)24h以劑量依賴方式抑制高糖刺激的胰島素釋放和胰島素含量在INS-1細(xì)胞中，并伴隨PDX