PDX-1基因克隆載體的體外構(gòu)建.pdf

1、1:PDX-1基因克隆載體的體外構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建PDX-1基因的克隆載體,為真核表達(dá)載體的構(gòu)建及研究PDX-1誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。
　　方法:采用Trizol方法從大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株中提取RNA,通過(guò)RT-PCR方法在體外擴(kuò)增大鼠PDX-1 cDNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定,割膠純化后回收目的基因,與pMD-18T克隆載體連接構(gòu)建,經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切及DNA序列分析鑒定pMD-18T-PDX-1的正確構(gòu)建。

2、
　　結(jié)果:正確構(gòu)建了含有PDX-1 cDNA的克隆載體pMD-18T-PDX-1,其中PDX-1 cDNA全長(zhǎng)為908bp。
　　結(jié)論:在體外成功克隆了PDX-1基因,并正確構(gòu)建了PDX-1基因克隆載體,對(duì)進(jìn)一步進(jìn)行PDX-1在真核細(xì)胞中的表達(dá)及研究PDX-1在干細(xì)胞定向分化中的作用具有重要的意義。
　　2:體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化
　　目的:體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)

3、分化為胰島素分泌細(xì)胞,探討誘導(dǎo)分化過(guò)程中干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的潛能及功能變化趨勢(shì)。
　　方法:體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,培養(yǎng)至貼壁80％,將間充質(zhì)干細(xì)胞分兩組, A組為誘導(dǎo)組,B組為對(duì)照組。A組先后予以1mmol/L2-巰基乙醇培養(yǎng)2天,10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及2% B27培養(yǎng)7天,之后添加20mmol/L尼克酰胺及艾塞那肽培養(yǎng)7天。B組不添加試劑,繼續(xù)換液培養(yǎng)。通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)變

4、化、RT-PCR體外擴(kuò)增兩組細(xì)胞的PDX-1基因的cDNA、放射免疫法測(cè)定兩組細(xì)胞胰島素分泌量三種方法來(lái)鑒定胰島素分泌細(xì)胞。
　　結(jié)果:(1)通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察,可見(jiàn)未分化的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,分界清楚,傳代后細(xì)胞呈纖維樣生長(zhǎng),而 A組細(xì)胞逐漸變小,呈圓形,折光性變強(qiáng),細(xì)胞聚集成團(tuán),類(lèi)似胰島樣細(xì)胞,B組細(xì)胞仍呈長(zhǎng)梭形,分界清楚,纖維樣生長(zhǎng);(2)RT-PCR: A組細(xì)胞可擴(kuò)增出PDX-1基因的 cDNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,P