AMPK對INS-1細胞下游分子及胰島素分泌的影響.pdf

1、胰島β細胞功能下降及外周組織胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特征。臨床常用口服降血糖藥二甲雙胍能夠激活外周組織細胞內(nèi)AMPK(AMP-ActivatedProtein Kinase)，增加組織攝取葡萄糖，改善外周組織胰島素抵抗，降低血糖。AMPK，即AMP活化的蛋白激酶，最主要的生物學效應(yīng)是通過感受胞漿內(nèi)AMP/ATP比值的變化，調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化代謝。在胰島β細胞，葡萄糖通過氧化代謝直接改變細胞內(nèi)腺苷酸水平，表現(xiàn)為高糖抑制AMPK表達和活性

2、。目前關(guān)于AMPK對外周組織影響的研究較多，對胰島β細胞的研究主要集中在對胰島素分泌方面，且報道不一，同時AMPK對β細胞下游靶分子的研究也很少。 PDX-1(Pancreatic/Duodenal Homeobox-1)，即胰腺十二指腸同源異型盒因子-1，是一種在胰島β細胞特異表達的轉(zhuǎn)錄因子，在β細胞的發(fā)生、分化、成熟以及再生等過程中起重要作用。能夠促進胰島素及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，對胰島細胞內(nèi)分泌功能起重要調(diào)節(jié)作用。目前國內(nèi)外對A

3、MPK和PDX-1分別都有大量研究，但二者關(guān)系不清楚，僅有一篇報道同時涉及AMPK與PDX-1，探討二者相關(guān)性。PDX-1是否受．AMPK調(diào)控，是否是．AMPK下游分子，有待進一步研究。 過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome Proliferator-Activated Receptors，PPARs)是配體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，屬核受體超家族成員。PPARa、PPAR7是PPARs家族的兩個亞型，目前PPARa和PPAR

4、7的激動劑在臨床上主要用于調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和改善胰島素敏感性。在胰島細胞和骨骼肌細胞有AMPK影響PPARa表達的報道，那么，除PDX-1外，PPARa可能也是AMPK的下游分子。另外，PPARa和PPARγ具有相同的PPRE序列，在PDX-1啟動子上已發(fā)現(xiàn)與PPRE相似的序列，是否AMPK也影響PPARγ呢?由此我們假設(shè)PDX-1，PPARa和PPARγ都是AMPK的下游分子。如果假設(shè)成立，PPARa、PPARγ是否參與AMPK對PDX-

5、1調(diào)控? 目的： 1．AMPK活性改變是否影響PDX-1、PPARa和PPAR7的表達，即PDX-1、PPARa和PPARγ是否是AMPK的下游分子； 2．PPARa和PPARγ/是否參與AMPK對PDX-1的調(diào)控作用； 3．“生理狀態(tài)”下，觀察AMPK對胰島素含量及葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)功能的影響。 方法： INS-1細胞分為八組：C組，正常組；A組，0.5mMAICAR(A

6、MPK(激動劑)；CC組，10μM Compound C(AMPK阻斷劑)；AC組，0.5mMAICAR+10μMCompound C；M組，5μM MK886(PPARa阻斷劑)；AM組，0.5mMAICAR+5μM MK886；B組，50μM BADGE(PPARγ阻斷劑)；AB組，0.5mM AICAR+50μM BADGE。RT-PCR和實時定量RT-PCR檢測INS-1細胞PDX-1、PPARa和PPAR7基因轉(zhuǎn)錄水平的表達；

7、Western blot檢測細胞核內(nèi)及胞漿內(nèi)PDX-1蛋白水平表達；免疫沉淀檢測總蛋白中PPARa蛋白水平表達。放射免疫法測定胰島素濃度。 結(jié)果： 1．PDX-1，PPARa，PPARγ表達水平的變化：與正常對照組相比，AMPK在AICAR作用下激活時，PDX-1，PPARa和PPAR3,mRNA水平均顯著上升；與A組比較，AMPK在Compound C作用下失活時，PDX-1，PPARa和PPARγmRNA水平下降。蛋

8、白表達水平：AMPK激活時，總蛋白中PPARa與核內(nèi)PDX-1蛋白表達水平與正常對照組相比上升；與A組相比，AMPK失活時總PPARa蛋白與核PDX-1蛋白表達水平下降。 2．PPARa/PPARγ阻斷劑對核內(nèi)PDX-1蛋白水平的影響：與A組相比，AM組和AB組核內(nèi)PDX-1蛋白水平顯著下降；AM組與M組之間，AB組與B組之間PDX-1蛋白水平變化不顯著。 3．細胞內(nèi)胰島素含量和葡萄糖刺激胰島素分泌(GSIS)功能的變化

9、：與正常對照組相比，AMPK激活顯著降低INS-1細胞內(nèi)胰島素含量。同時，也降低GSIS和胰島素分泌指數(shù)(ISI)。 結(jié)論： ①AMPK對PDX-1，PPARct和PPAR7的表達均有調(diào)控作用，PDX-1，PPARa和PPARγ是AMPK的下游分子； ②PPARa/PPARγ參與AMPK對PDX-1的調(diào)控，提示INS-1細胞中存在AMPK-PPARoYPPARy-PDX-1通路； ③“生理狀態(tài)”下，AMP