Pdx-1基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾對(duì)限食后追趕生長(zhǎng)大鼠胰島功能變化的作用.pdf

1、目的:觀察限食后追趕生長(zhǎng)大鼠模型中胰島形態(tài)和功能變化及其可能的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
　　 方法:48只5W 齡雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1W后，隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組（NC）（n=24）和限食后追趕生長(zhǎng)組（CUGRF）（n=24）。兩組整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均給予普通飼料，其中NC組整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均給予自由進(jìn)食，CUGRF組前6周先給予同年齡NC組進(jìn)食量的60％，然后開放自由進(jìn)食，檢測(cè)大鼠體重和進(jìn)食量，分別于追趕生長(zhǎng)0周、8周，12周和16

2、周（開放進(jìn)食0周、8周，12周和16周）時(shí)測(cè)定游離脂肪酸（FFA），甘油三酯（TG），膽固醇（TC）。分別于追趕生長(zhǎng) 0、8、16周時(shí)測(cè)定以下指標(biāo)：高葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)觀察胰島分泌功能；胰島素免疫組化染色后計(jì)算胰島面積，胰島素陽性面積比率和平均光密度值；胰腺TUNEL 染色計(jì)算胰島β細(xì)胞凋亡率；胰腺Pdx-1，Bcl-2，Bax的實(shí)時(shí)定量PCR分析mRNA表達(dá)情況。分別于追趕生長(zhǎng)0、8、16周時(shí)應(yīng)用ChIP 技術(shù)分析CUGFR和NC組大鼠的

3、胰島中提取的的交聯(lián)染色質(zhì)。免疫沉淀使用抗體為乙?；疕3 抗體，H3K4me3 抗體和H3K9me2 抗體。以實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)合到Pdx-1 啟動(dòng)子上的乙酰化H3，H3K4me3和H3K9me2的相對(duì)量，以input DNA為校正值。
　　 結(jié)果:
　　 1.限食后追趕生長(zhǎng)動(dòng)物模型的建立CUGFR組大鼠在限食6周內(nèi)攝食量為NC組的60％。開放自由進(jìn)食后CUGFR組大鼠進(jìn)食量超過NC組，開放2周后兩組進(jìn)食量比較差異無統(tǒng)計(jì)

4、學(xué)意義。CUGRF組大鼠限食期體重緩慢增加；開放進(jìn)食后體重逐漸增加，從追趕第14周起與NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。追趕生長(zhǎng)0周，8周，12周FFA水平無顯著差異；追趕生長(zhǎng)16周時(shí)CUGFR組較NC組FFA顯著升高。追趕生長(zhǎng)0周TG水平無顯著差異；開放進(jìn)食后TG在兩組間差異具有顯著性。在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)CUGFR組與NC組TC相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.限食后追趕生長(zhǎng)大鼠胰島形態(tài)和功能的變化CUGFR組空腹血糖和血清胰島素在限食

5、期結(jié)束時(shí)及自由進(jìn)食后8周，16周與NC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是在CUGFR0周，8周，16周胰島素一相分泌顯著低于NC組，其余各時(shí)間點(diǎn)與NC組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖像分析結(jié)果顯示，各觀察時(shí)間點(diǎn)CUGFR組胰島染色陽性面積比率均較NC組降低。CUGFR組0周，8周胰島素平均光密度值與同齡NC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，16周CUGFR組胰島素平均光密度值較NC組顯著降低。TUNEL 染色顯示追趕生長(zhǎng)8周、16周兩組胰島凋亡率明顯升高，差異

6、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CUGFR組胰腺Bcl-2 mRNA表達(dá)水平在限食后追趕生長(zhǎng)各周均顯著低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bax mRNA在追趕生長(zhǎng)各周與NC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bcl-2/Bax 比率在追趕生長(zhǎng)0周時(shí)兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。追趕生長(zhǎng)8周，16周時(shí)CUGFR組較NC組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.限食后追趕生長(zhǎng)大鼠胰島Pdx-1表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)組蛋白甲基化修飾Real time PCR及western blo

7、t 均顯示CUGFR組胰腺Pdx-1 mRNA表達(dá)水平和蛋白水平較NC組在追趕生長(zhǎng)各周均顯著下降。Pdx-1 啟動(dòng)子乙?；M蛋白H3的富集在CUGFR組0周、8周、16周隨著年齡增長(zhǎng)逐漸下降，與NC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在各個(gè)年齡大鼠NC組H3K4me3在Pdx-1啟動(dòng)子區(qū)高度富集，而CUGFR組H3K4me3的富集程度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ChIP 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NC組Pdx-1 啟動(dòng)子H3K9me2 富集程度較低，隨著年齡增加CU

8、GFR組H3K9me2 較NC組富集程度顯著升高。
　　 結(jié)論：限食后追趕生長(zhǎng)過程中大鼠胰島形態(tài)和胰島分泌功能均發(fā)生了相應(yīng)變化，胰島素第一時(shí)相分泌功能明顯受損，推測(cè)Pdx-1表達(dá)降低和胰島凋亡增加共同參與了胰島素一相分泌受損的病理過程。組蛋白修飾在限食后追趕生長(zhǎng)大鼠模型中有顯著變化，可能是Pdx-1基因表達(dá)下調(diào)的表觀遺傳學(xué)改變機(jī)制之一。
　　 第一部分限食后追趕生長(zhǎng)動(dòng)物模型的建立
　　 目的：觀察限食后開放進(jìn)食對(duì)

9、大鼠進(jìn)食量、體重、血脂等指標(biāo)的影響，從而構(gòu)建出符合本實(shí)驗(yàn)要求的限食后追趕生長(zhǎng)動(dòng)物模型。評(píng)價(jià)血清GH，IGF-1，Ghrelin，leptin，CCK水平并與IUGR模型進(jìn)行比較。
　　 方法：48只5W齡雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1W后，隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組（NC）（n=24）和限食后追趕生長(zhǎng)組（CUGRF）（n=24）。兩組整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均給予普通飼料，其中NC組整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均給予自由進(jìn)食，CUGRF組前6周先給予同年齡NC

10、組進(jìn)食量的60％，然后開放自由進(jìn)食。每天測(cè)大鼠體重和進(jìn)食量，分別于追趕生長(zhǎng)0周、8周，12周和16周（開放進(jìn)食0周、8周，12周和16周）時(shí)測(cè)定血清游離脂肪酸（FFA），甘油三酯（TG），膽固醇（TC），生長(zhǎng)激素（GH），胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1），胃饑餓素（ghrelin），瘦素（leptin），膽囊收縮素（CCK）等指標(biāo)。
　　 結(jié)果：
　　 1.CUGFR組大鼠在限食6周內(nèi)攝食量為NC組的60％。開放自由進(jìn)

11、食后CUGFR組大鼠進(jìn)食量超過NC組，開放2周后兩組進(jìn)食量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.CUGRF組大鼠限食期體重緩慢增加；開放進(jìn)食后體重逐漸增加，從追趕第14周起與NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.追趕生長(zhǎng)0周FFA水平無顯著差異；追趕生長(zhǎng)16周時(shí)CUGFR組較NC組FFA顯著升高。追趕生長(zhǎng)0周TG水平無顯著差異；開放進(jìn)食后TG在兩組間差異具有顯著性。各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)CUGFR組與NC組TC相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

12、br>　　 4.CUGFR組GH在追趕生長(zhǎng)0周顯著升高，追趕8周時(shí)下降，在追趕12、16周時(shí)兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CUGFR組leptin在追趕生長(zhǎng)0周顯著降低，開放進(jìn)食后各觀察時(shí)間點(diǎn)leptin差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清IGF-1，ghrelin，CCK濃度兩組間在各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功造成完全追趕生長(zhǎng)大鼠模型，伴有FFA和TG水平升高，垂體激素GH、脂肪因子leptin在追趕生長(zhǎng)大鼠模型中其分泌水平

13、有顯著變化并可能與胃腸神經(jīng)肽CCK等能量平衡調(diào)節(jié)的因子共同參與了脂肪沉積，胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的形成以及糖代謝障礙。
　　 第二部分限食后追趕生長(zhǎng)大鼠胰島形態(tài)和功能的變化
　　 目的：觀察限食后追趕生長(zhǎng)大鼠胰島形態(tài)和功能以及調(diào)節(jié)胰島素分泌的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的變化，初步探討限食后追趕生長(zhǎng)大鼠胰島功能變化的可能機(jī)制。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分組及造模方法同實(shí)驗(yàn)一。分別于追趕生長(zhǎng) 0、8、16周時(shí)測(cè)定以下指標(biāo)：高葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)觀察胰島

14、分泌功能；胰島素免疫組化染色后計(jì)算胰島面積，胰島素陽性面積比率和平均光密度值；胰腺TUNEL 染色計(jì)算胰島β細(xì)胞凋亡率；
　　 胰腺Bcl-2，Bax的實(shí)時(shí)定量PCR分析mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.CUGFR組空腹血糖和血清胰島素在限食期結(jié)束時(shí)及自由進(jìn)食后8周，16周與NC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。限食結(jié)束后NC組在高葡萄糖刺激5min后，胰島素水平顯著升高，而CUGFR組的胰島素基本保持在基礎(chǔ)水平

15、，分泌顯著低于NC組。CUGFR 8周葡萄糖負(fù)荷后10min 時(shí)胰島素分泌顯著低于NC組；16周時(shí)5min 胰島素分泌顯著低于NC組，其余各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.圖像分析結(jié)果顯示，CUGFR組0周，8周，16周的胰島大小與同齡NC組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各周齡CUGFR組胰島染色陽性面積比率均較NC組降低。CUGFR組0周，8周胰島素平均光密度值與同齡NC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，16周CUGFR組胰島素平均光密度值較NC

16、組顯著降低。
　　 3.TUNEL 染色顯示限食后追趕生長(zhǎng)0周時(shí)CUGFR組和NC組凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。追趕生長(zhǎng)8周、16周兩組胰島凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.CUGFR組胰腺Bcl-2 mRNA表達(dá)水平在限食后追趕生長(zhǎng)各周均顯著低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bax mRNA在追趕生長(zhǎng)各周與NC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bcl-2/Bax 比率在追趕生長(zhǎng)0周時(shí)兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，追趕生長(zhǎng)8周，16周

17、時(shí)CUGFR組較NC組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：限食后追趕生長(zhǎng)過程中大鼠胰島凋亡增加，胰島素第一時(shí)相分泌功能明顯受損,可能與細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。
　　 第三部分追趕生長(zhǎng)大鼠胰島Pdx-1啟動(dòng)子組蛋白修飾
　　 目的：運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)研究限食后追趕生長(zhǎng)大鼠模型Pdx-1表達(dá)水平和胰島染色質(zhì)Pdx-1基因啟動(dòng)子區(qū)乙?；M蛋白H3，H3K4me3和H3K9me2的變化，以進(jìn)一步探討限食后追趕生長(zhǎng)可

18、能引起β細(xì)胞功能損傷的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分組及造模方法同第二部分。分別于追趕生長(zhǎng)0、8、16周時(shí)用實(shí)時(shí)定量PCR分析胰腺Pdx-1 mRNA表達(dá)；Western blot 方法檢測(cè)Pdx-1 蛋白表達(dá)；應(yīng)用ChIP 技術(shù)分析CUGFR和NC組大鼠的胰島中提取的的交聯(lián)染色質(zhì)。免疫沉淀使用抗體為乙?；疕3 抗體，H3K4me3 抗體和H3K9me2 抗體。以實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)合到Pdx-1 啟動(dòng)子上的乙?；疕3，H

19、3K4me3和H3K9me2的相對(duì)量，以input DNA為校正值。
　　 結(jié)果：Real time PCR及western blot 均顯示CUGFR組胰腺Pdx-1 mRNA表達(dá)水平和蛋白水平均較NC組在追趕生長(zhǎng)各周均顯著下降。Pdx-1 啟動(dòng)子乙?；M蛋白H3的富集在CUGFR組0周、8周、16周隨著年齡增長(zhǎng)逐漸下降，與NC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在各個(gè)年齡大鼠NC組H3K4me3在Pdx-1 啟動(dòng)子區(qū)高度富集，而CUGF