2E8-NCTD-脂質(zhì)體體外靶向B系白血病干細(xì)胞及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：B系淋巴細(xì)胞白血病是兒童常見的惡性腫瘤，目前化療仍是對其治療的主要手段。雖然大部分患兒對初始化療反應(yīng)較好，但約有20％左右的患兒由于不能耐受常規(guī)化療非特異性毒副作用，導(dǎo)致化療失敗或白血病復(fù)發(fā)。最近研究發(fā)現(xiàn)：從B淋巴細(xì)胞白血病患兒的體內(nèi)分選出CD34+CD19+CD38+/-的細(xì)胞注射入新生的NOD/SCID小鼠體內(nèi)能長出B系白血病細(xì)胞，而CD34+CD19-CD38-CD10-的細(xì)胞注射入新生的NOD/SCID小鼠體內(nèi)則

2、表現(xiàn)為正常的細(xì)胞表型[7].可見CD34+CD19+CD38+/-細(xì)胞具有自我更新和無限增殖的能力，其也完全不同于髓系白血病干細(xì)胞(AML-LSC)，是一類新的干細(xì)胞群--B系LSCs。因此，CD19是B系LSCs及其子代白血病細(xì)胞表面的特異性標(biāo)記，是靶向殺傷B系LSC及其子代白血病細(xì)胞的良好靶點。
　　 目前以單克隆抗體(單抗)為基礎(chǔ)的靶向治療是白血病治療最有前途的方法之一。CD20和CD33等單抗已在臨床分別廣泛應(yīng)用于B系非

3、霍杰金淋巴瘤(B-NHL)和AML的治療[8-10]。免疫脂質(zhì)體是靶向治療的分支之一，具有單抗導(dǎo)向和脂質(zhì)體藥物傳輸?shù)碾p重特性。將免疫脂質(zhì)體包封抗腫瘤藥物，不但可將大量的藥物分子特異地傳輸?shù)侥[瘤細(xì)胞，還可顯著減少對正常組織的非特異性毒性作用。據(jù)報道大量的藥物分子甚至可以克服腫瘤耐藥[19].目前，免疫脂質(zhì)體治療B系血液腫瘤的研究已取的了令人鼓舞的結(jié)果，如CD19靶向的柔紅霉素(DXR)和長春新堿(VCR)脂質(zhì)體等在體外能顯著增加對CD19

4、+的白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，在體內(nèi)能顯著延長B系模型小鼠的生存時[12-18]，CD19靶向的伊馬替尼(imatinib)脂質(zhì)體能將大量的伊馬替尼分子傳輸?shù)絊UP-15細(xì)胞內(nèi)，克服了低劑量imatinib所導(dǎo)致的imatinib耐藥問題[19]。然而目前報道的免疫脂質(zhì)體不能有效清除LSCs，因為象DXR和VCR等常規(guī)化療藥不能作用于靜止期的LSCs。
　　 去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)是干細(xì)胞特異性的殺傷

5、藥物，其通過抑制干細(xì)胞相關(guān)的抗凋亡軸——即下調(diào)(HLF/SLUG)的活性，誘導(dǎo)AML-LSCs凋亡[20]。但NCTD對正常HSCs的殺傷作用在一定程度上削弱了其對LSCs的治療優(yōu)勢。
　　 ZCH-4-2E8(簡稱2E8)是本實驗室自行研制的抗人CD19單抗的新克隆，在先前的研究中，我們已證實2E8-NCTD免疫毒素對CD19+的白血病細(xì)胞具有明顯的靶向殺傷作用[21]。
　　 本研究擬采用免疫脂質(zhì)體技術(shù)，將NCTD包

6、封于脂質(zhì)體中，并與2E8單抗連接，研制成2E8-NCTD-liposomes，觀察該免疫脂質(zhì)體靶向識別并殺傷B系LSCs及其子代白血病細(xì)胞的作用，闡明其靶向殺傷的機(jī)制，為其進(jìn)行體內(nèi)試驗奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 (1)2E8單克隆抗體的制備
　　 采用凝膠過濾層析法從腹水中純化2E8單抗；流式細(xì)胞術(shù)檢測其對CD19高表達(dá)的Nalm-6細(xì)胞的靶向效率；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)鑒定

7、抗體純度及分子量。
　　 (2)2E8單克隆抗體修飾的空白脂質(zhì)體(blank-liposomes)的制備及評價
　　 采用分光光度計建立Stewart分析法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(檢測脂質(zhì)體中磷脂的含量)。采用后插技術(shù)將2E8與biank-liposomes連接，制備2E8-blank-liposomes；并用流式細(xì)胞術(shù)證明兩者是否連接成功(為做流式檢測， Rhodamine標(biāo)記的磷脂酰乙醇胺一-PE，加入脂質(zhì)體的磷脂中)；結(jié)合St

8、ewart分析法和BCA蛋白濃度檢測法考察2E8和Mal-PEG2000-DSPE摩爾比對脂質(zhì)體表面抗體密度的影響；SDS-PAGE驗證2E8是否以完整的形式插入脂質(zhì)體表面；激光粒度測定儀檢測其粒徑并觀察其在不同溶液中放置不同時間是否穩(wěn)定.流式細(xì)胞術(shù)評價2E8-blank-liposomes和blank-liposomes對不同細(xì)胞株(Nalm-6，Raji，Molt-3，K562)和健康者外周血中T、B淋巴細(xì)胞的靶向效率以及靶向結(jié)合的

9、穩(wěn)定性；流式細(xì)胞術(shù)檢測游離2E8阻滯2E8-blank-liposomes對CD19抗原的特異性結(jié)合能力；激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)(木瓜酶法)觀察2E8-blank-liposomes在Nalm-6細(xì)胞中的內(nèi)化作用。
　　 (3)2E8單抗修飾的去甲斑蝥素脂質(zhì)體(NCTD-liposomes)的制備及評價
　　 首先建立脂質(zhì)體包封率檢測的高效液相色譜法(HPLC)。采用薄膜分散法制備NCTD-Iiposomes，并通

10、過后插技術(shù)將2E8與NCTD-Iiposomes連接，制備2E8-NCTD-liposomes。HPLC測定脂質(zhì)體的包封率；激光粒度測定儀檢測其粒徑；流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡評價2E8-NCTD-liposomes和NCTD-Iiposomes對不同細(xì)胞株(Nalm-6，Raji，Molt-3，K562)的靶向效率和差異；流式細(xì)胞術(shù)檢測B淋巴細(xì)胞白血病病人骨髓及Nalm-6細(xì)胞株中B系LSC(CD34+CD19+CD38+/-)的靶

11、向效率；MTT法評價2E8-NCTD-liposomes，NCTD-Iiposomes和游離的NCTD對不同細(xì)胞株(Nalm-6，Molt-3)的細(xì)胞毒作用，并計算各自IC50值。
　　 (4)2E8-NCTD-liposomes的靶向殺傷機(jī)制
　　 采用激光共聚焦顯微鏡和HPLC觀察2E8-NCTD-liposomes通過CD19受體介導(dǎo)的內(nèi)化作用將NCTD轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象.HE染色和瓊脂糖凝膠電泳觀察2E8-NCT

12、D-liposomes處理后Nalm-6細(xì)胞發(fā)生凋亡改變(凋亡小體和DNA ladder)；流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC和PI雙標(biāo)法)檢測2E8-NCTD-liposomes處理后Nalm-6細(xì)胞的早期凋亡，并定量檢測相同濃度的2E8-NCTD-liposomes，NCTD-Iiposomes和游離的NCTD對Nalm-6和Molt-3凋亡的影響以及不同濃度的2E8-NCTD-liposomes對Nalm-6細(xì)胞凋亡的影響，

13、實時熒光定量PCR的方法檢測2E8-NCTD-liposomes處理后Nalm-6細(xì)胞中與B系LSCs相關(guān)的抗凋亡因子HLF和其下游的促凋亡因子NFIL3在轉(zhuǎn)錄水平的相對表達(dá)規(guī)律。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功研制CD19抗體修飾的免疫脂質(zhì)體2E8-blank-liposomes和2E8-NCTD-liposomes；
　　 2.2E8-blank-liposomes可作為靶向B系LSC(CD34CD19+CD3

14、8+/-)及其子代白血病細(xì)胞( CD19+)有用的藥物載體；
　　 3.2E8-NCTD-liposomes可對B系白血病細(xì)胞產(chǎn)生靶向細(xì)胞殺傷作用；
　　 4.2E8-NCTD-liposomes靶向殺傷B系白血病細(xì)胞的作用機(jī)制是通過CD19受體介導(dǎo)而發(fā)生內(nèi)化，NCTD被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)釋放，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡；
　　 5.2E8-NCTD-liposomes謗導(dǎo)B系LSC凋亡與抑制LSC相關(guān)的抗凋亡軸——HLF/SLU