低氧預(yù)適應(yīng)對自體原位肝移植大鼠肝細胞HIF-1及EGR-1表達影響的實驗研究.pdf

1、1目的
　　 本實驗在大鼠自體原位肝移植(AOLT)模型基礎(chǔ)上，通過對供肝大鼠術(shù)前低氧預(yù)適應(yīng)(HP)處理，探討HP肝移植大鼠術(shù)后肝細胞的功能、結(jié)構(gòu)變化，低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1)表達與早期生長反應(yīng)因子1(early growth responsefactor-1 EGR-1)的相互關(guān)系。
　　 2方法
　　 2.1清潔SD純系大鼠隨機分為3組：低氧預(yù)適應(yīng)大

2、鼠自體原位肝移植組(A組n=36)：供體術(shù)前行HP(術(shù)前給予氣體流量5 L/min的含8％氧的氮氧混合氣體處理90 min)，8 h后行大鼠自體肝移植；大鼠自體肝移植組(B組n=36)：大鼠行自體原位肝移植；正常大鼠對照組(C組n=6)。兩組肝移植大鼠均采用門靜脈灌注的自體原位肝移植模型。
　　 2.2比較大鼠自體肝移植術(shù)后不同時間段的指標變化。各組大鼠切取肝中葉及抽取下腔靜脈血作為標本，在光鏡、透射電鏡下觀察肝細胞病理學改變、

3、肝細胞線粒體的損傷情況，檢測肝功能指標變化，RT-PCR技術(shù)檢測肝臟組織HIF-1RNA和TNF-α RNA表達的變化結(jié)果，Western蛋白印跡法檢測肝臟組織EGR-1的變化結(jié)果。
　　 3結(jié)果
　　 3.1手術(shù)成功的標準是術(shù)后大鼠即刻蘇醒，翻身，并能維持有效呼吸、心跳。經(jīng)門靜脈灌注，肝臟熱缺血時間可以忽略不計(一般<5s)。無肝期結(jié)束后，A組肝臟復(fù)色均勻，紅潤，很快即有膽汁流出。B組較A組復(fù)色差，膽汁分泌差。

4、　　 3.2各組肝功能測定結(jié)果表明：
　　 術(shù)后2hA組和B組的ALT和AST值最高，術(shù)后12h及24hALT和AST值慢慢恢復(fù)正常。在各時間段中，A組的血清ALT和AST水平顯著低于B組，但均顯著高于C組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。
　　 3.3光鏡下術(shù)后各組肝細胞的病理變化：
　　 肝組織結(jié)構(gòu)的術(shù)后2h改變，A組術(shù)后2h，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細胞輕微腫脹，肝組織無明顯改變；B組術(shù)后2h，中央靜

5、脈周圍的肝細胞明顯腫脹，肝細胞之間的間隙變寬，肝血竇變窄，肝小葉結(jié)構(gòu)不明顯，內(nèi)有淤積的紅細胞和血栓，周圍開始出現(xiàn)炎癥細胞浸潤；C組術(shù)后2h，肝細胞結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細胞浸，肝組織無明顯改變。術(shù)后12h A組肝細胞腫脹略重，肝組織無明顯改變；B組肝細胞水腫加劇，肝血竇明顯變窄，肝小葉結(jié)構(gòu)不明顯，內(nèi)有淤積的紅細胞和血栓，周圍開始出現(xiàn)炎癥細胞浸潤；C組肝細胞無明顯改變。術(shù)后24h，A組肝細胞腫脹輕微好轉(zhuǎn)，肝血竇變寬。B組，肝細胞明顯腫脹，肝血竇

6、變窄，肝小葉結(jié)構(gòu)不明顯；C組術(shù)后2h肝組織無明顯改變。
　　 3.4透射電子顯微鏡下各組肝細胞中線粒體：
　　 術(shù)后2h，A組大鼠線粒體腫脹較輕，橢圓形，周圍內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)尚存；B組，線粒體大小不一，明顯腫脹，呈類圓形；術(shù)后12h，A組大鼠線粒體腫脹略加重，內(nèi)嵴部分斷裂，但仍有少量排列。周圍內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)尚存；B組線粒體腫脹加劇，嚴重者可見嵴減少、斷裂或消失，周圍內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞；術(shù)后24h，A組大鼠線粒體腫脹略輕，損壞未加劇，周

7、圍內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)尚存；B組線粒體腫脹加劇，內(nèi)有空泡變性，可見嵴斷裂或消失嚴重；
　　 3.5 HIF-1RNA表達結(jié)果：
　　 C組中肝組織見少量HIF-1α的表達，各時間段無明顯波動；B組因術(shù)中灌肝缺氧致有HIF-1α RNA表達，可見表達量介于對照組和低氧預(yù)適應(yīng)組，術(shù)后表達量波動增強不明顯；而A組因術(shù)前低氧誘導(dǎo)致HIF-1RNA的表達比B組和C組更明顯，其表達量見表一：術(shù)后1小時HIF-1α/GAPDH為0.82，之后持

8、續(xù)升高，6小時HIF-1/GAPDH最高為1.25(誤差率<5％)。
　　 3.6 TNF-α RNA表達結(jié)果：
　　 C組中肝組織見少量TNF-α的表達，各時間段無明顯波動；A組TNF-α RNA表達，可見表達量介于對照組和低氧預(yù)適應(yīng)組；而B組TNF-α RNA的表達比低氧預(yù)適應(yīng)大鼠自體肝移植組和對照組更明顯(P<0.05)，與Egr-1蛋白表達呈正相關(guān)。其表達量見：術(shù)后2小時TNF-α/GAPDH為0.77，之后持續(xù)

9、升高，24小時TNF-α/GAPDH最高為1.44(誤差率<5％)。
　　 3.7 Western蛋白印跡檢測：
　　 C組檢測到Egr-1蛋白表達量較少。B組和A組的Egr-1蛋白表達量術(shù)后都增多，其中B組明顯增多。Egr-1的WB數(shù)據(jù)顯示：B組因術(shù)中肝臟缺血等損傷致Egr-1移植后12 h即有明顯表達增多，Egr-1/action為0.78，移植后24 h其表達增至最高值Egr-1/action為1.005。至48小