TAT-血紅素氧合酶-1融合蛋白對大鼠原位肝移植肝細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：肝臟缺血再灌注損傷導(dǎo)致的移植肝臟功能衰竭或早期無功能是原位肝臟移植術(shù)后的嚴(yán)重并發(fā)癥。研究表明，肝細(xì)胞凋亡是肝臟缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。有研究報(bào)道，通過運(yùn)用藥物、器官缺血預(yù)處理、熱休克等誘導(dǎo)血紅素氧合酶-1(HO-1，熱休克蛋白32)高表達(dá)，可以減輕器官的缺血再灌注損傷。HO-1是機(jī)體血紅素分解代謝過程中的限速酶，催化血紅素氧化分解產(chǎn)生一氧化碳(CO)、膽綠素和Fe2+，具有抗凋亡、抗氧化損傷、減輕炎癥反應(yīng)等作用，在器官保護(hù)方

2、面引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTDs)是一小段不依賴于傳統(tǒng)的受體或細(xì)胞吞噬作用、可以自由地穿過生物膜的肽鏈，蛋白質(zhì)或多肽與PTDs相連后可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)保持其活性并發(fā)揮其生物功能。其中，包含11氨基酸(肽序列：YGRKKRRQRRR)的HIV反式激活蛋白(TAT)是目前研究最廣泛的蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)導(dǎo)域。有研究證實(shí)，TAT與HO-1的融合蛋白(TAT-HO-1)可以在大鼠心臟冷保存期成功轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入心肌細(xì)胞并保持其生物活性，延長心臟冷

3、保存期時(shí)間、減輕移植心臟的缺血再灌注損傷。但關(guān)于其在肝移植缺血再灌注損傷中作用的研究鮮有報(bào)道。本研究前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TAT-HO-1融合蛋白可以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入離體培養(yǎng)的L-02細(xì)胞及在體大鼠肝組織細(xì)胞、在冷保存期可轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入大鼠肝臟并減輕肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(SECs)凋亡，對肝功能有一定的保護(hù)作用。本研究探討TAT與HO-1融合蛋白能否轉(zhuǎn)導(dǎo)入大鼠原位肝移植肝細(xì)胞，以及對移植肝臟功能和細(xì)胞凋亡情況的影響。
　　 方法：將HO-1

4、cDNA編碼區(qū)與合成的TAT-PTD片斷連接到原核表達(dá)載體pET32a上，構(gòu)建TAT-HO-1-pET32a質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定后，轉(zhuǎn)化E.coliBL-21(DE3)菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、Ni-NTA-agarose（Novagen公司，德國）純化，Western blot法對TAT-HO-1進(jìn)行定性分析，化學(xué)法檢測TAT-HO-1活性，證實(shí)所得蛋白為有活性的TAT-HO-1融合蛋白(1mg/ml)后進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。
　　 健康成

5、年雄性SD大鼠，體重250～280g，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為供體組和受體組。將受體大鼠隨機(jī)分為2組(n=24)：對照組(C組)和蛋白組（P組）。參照Kamada等的二袖套法建立大鼠原位肝移植模型。C組和P組分別于肝移植術(shù)畢經(jīng)陰莖背靜脈注射生理鹽水10ml/kg、TAT-HO-1融合蛋白10ml/kg(10mg/kg)。兩組分別于分離肝臟血管及周圍韌帶完畢切取肝臟前即刻(T0)、肝臟移植術(shù)后1h(T1)、6h(T2)和12h(T3)時(shí)各隨機(jī)

6、選取6只大鼠，乙醚麻醉后開腹經(jīng)腹主動脈采血3m1分離血清，并切取肝組織標(biāo)本立即液氮冷凍，血清與肝組織均置于-80℃冰箱保存。
　　 應(yīng)用免疫組化染色法檢測肝臟組織HO-1含量，分析TAT-HO-1轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入肝臟的情況。全自動生化分析儀測定血清ALT水平，放射免疫分析法檢測血清HA水平。原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)法分別檢測肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和SECs凋亡情況，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法(RT-PCR)檢測caspase-3mRNA

7、表達(dá)水平。蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.肝組織中HO-1含量兩組肝臟移植術(shù)后1h、6h、12h肝組織中可見明顯棕黃色HO-1陽性染色分布；與C組相比，P組肝組織中HO-1含量均高于C組（P＜0.05）。
　　 2.血清ALT和HA水平測定兩組各組內(nèi)血清ALT和HA水平T1～T3時(shí)均高于T0時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與C組比較，P組T0時(shí)ALT和HA水平

8、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，T1～T3時(shí)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和SECs凋亡情況與肝組織Caspase-3 mRNA水平兩組各組內(nèi)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和SECs的AI與肝組織Caspase-3 mRNA水平，在T2時(shí)高于其余各時(shí)點(diǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與C組比較，P組T0時(shí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和SECs AI與肝組織Caspase-3 mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，T1～

9、T3時(shí)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 4.組織病理學(xué)變化肝移植術(shù)畢6h，P組可見肝細(xì)胞濁腫，肝索輕度增寬，匯管區(qū)少量中性粒細(xì)胞浸潤；C組可見肝細(xì)胞濁腫及空泡變性，肝細(xì)胞點(diǎn)片狀壞死，匯管區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤增多。
　　 結(jié)論：TAT-HO-1融合蛋白在大鼠原位肝移植術(shù)后經(jīng)靜脈注射可以轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入大鼠移植肝臟，可能通過下調(diào)Caspase-3 mRNA表達(dá)水平，減輕肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和SECs凋亡，從而對大鼠肝移植術(shù)后的肝臟