人Sbaff-dt388融合蛋白在大桿菌表達(dá)及其活性研究.pdf

1、免疫毒素(Immunotoxins,IT),又被稱之為生物導(dǎo)彈,其具有專門(mén)選擇性的破壞某一特異性標(biāo)記細(xì)胞功能的一類(lèi)融合蛋白,它是通過(guò)通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方式將具有高度特異性的單克隆抗體與具有強(qiáng)大殺傷作用的毒素分子構(gòu)建而成。免疫毒素利用腫瘤細(xì)胞上導(dǎo)向分子的受體與細(xì)胞結(jié)合,進(jìn)入細(xì)胞后由毒素發(fā)揮蛋白質(zhì)合成抑制作用,最終能夠?qū)е掳屑?xì)胞的死亡,其具備了特異性的識(shí)別的功能和毒素殺傷的功能效應(yīng),對(duì)傳統(tǒng)的治療腫瘤化療、放療的缺陷進(jìn)行了彌補(bǔ)。
　　 B

2、淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulating factor,BAFF)屬腫瘤壞死因子家族新成員,因其在B細(xì)胞發(fā)育及自身免疫病中起重要作用而倍受關(guān)注。BAFF通過(guò)與其受體結(jié)合廣泛參與T、B淋巴細(xì)胞增殖和功能調(diào)節(jié),發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。BAFF的缺乏可導(dǎo)致免疫功能低下,過(guò)表達(dá)則與多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　 目的：
　　 為探討人sBAFF-DT388在B細(xì)胞惡性腫瘤及自身免疫性疾病中的治

3、療作用,我們進(jìn)行了人sBAFF-DT388融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建、重組蛋白的分離純化及其生物學(xué)活性的初步研究。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)優(yōu)化合成的hsBAFF-DT388基因序列設(shè)計(jì)引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增將目的基因片段插入到pMD19-T克隆載體,菌落PCR、限制性內(nèi)切酶酶切及DNA測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。
　　 2.重組克隆載體經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因,將其插入表達(dá)載體pColdⅡ相應(yīng)

4、酶切位點(diǎn),轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株,菌落PCR鑒定重組表達(dá)載體。
　　 3.挑取單克隆菌落擴(kuò)增培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE分析和Westernblot鑒定重組蛋白。
　　 4.Ni2+-NTA層析柱純化重組蛋白,經(jīng)透析后,SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白。
　　 5.利用PE熒光素標(biāo)記重組蛋白,檢測(cè)其與受體結(jié)合能力。
　　 6.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白對(duì)BAFF-R(+)B細(xì)胞株Hmy2

5、.CIR細(xì)胞的殺傷作用。
　　 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建了人sBAFF-DT388重組質(zhì)粒pMD-hsBAFF-DT388,測(cè)序結(jié)果顯示克隆目的基因序列與優(yōu)化后的人sBAFF-DT388基因序列完全一致。
　　 2.陽(yáng)性重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株后經(jīng)IPTG誘導(dǎo),行SDS-PAGE分析結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的陽(yáng)性重組菌株在58.4KD處出現(xiàn)明顯蛋白條帶

6、,符合目的蛋白大小,圖像掃描分析顯示獲得的目的蛋白約占菌體總蛋白的40％。Western blot結(jié)果顯示重組蛋白能與抗BAFF多克隆抗體和抗His-Tag多克隆抗體均能發(fā)生特異反應(yīng),表明獲得的重組蛋白為特異性hsBAFF-DT388融合蛋白。
　　 3.重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA層析柱純化,經(jīng)凝膠圖像掃描分析,hsBAFF-DT388重組蛋白純度達(dá)90％以上。
　　 4.熒光素標(biāo)記重組蛋白后在倒置熒光顯微鏡下可觀察到B

7、AFF-R(+)Hmy2.CIR細(xì)胞有較強(qiáng)紅色熒光出現(xiàn),而陰性對(duì)照組BAFF-R(-)U937細(xì)胞則未見(jiàn)熒光,表明重組蛋白與BAFF-R(+)Hmy2.CIR細(xì)胞表面受體具有特異性結(jié)合能力。
　　 5.細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白對(duì)BAFF-R(+)B細(xì)胞株Hmy2.CIR細(xì)胞的殺傷作用,結(jié)果顯示重組蛋白對(duì)其具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng),且抑制效應(yīng)具有劑量依賴關(guān)系,即隨著重組蛋白濃度的增加抑制效應(yīng)越強(qiáng)(P＜0.05)。而不同濃度的重組蛋白對(duì)陰性

8、對(duì)照組BAFF-R(-)U937細(xì)胞抑制效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 利用PCR技術(shù)成功克隆了人sBAFF-DT388目的基因,序列分析顯示與優(yōu)化后的基因序列一完全致;重組技術(shù)構(gòu)建pcoldⅡ-hsBAFF-DT388的原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株后獲得穩(wěn)定表達(dá)的工程菌株;初步探索優(yōu)化了重組pcoldⅡ-hsBAFF-DT388的表達(dá)條件、包涵體提取步驟及蛋白初步純化工藝;獲得了具有靶向