低濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)人椎間盤髓核細(xì)胞形態(tài)、生長和凋亡的影響.pdf

1、導(dǎo)致椎間盤退變的因素很多，而椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)減少是其中的因素之一。椎間盤是人體最大的無血管組織，營養(yǎng)供應(yīng)相對缺乏。椎間盤營養(yǎng)通過軟骨終板和纖維環(huán)這兩條途徑擴(kuò)散入椎間盤內(nèi)，而椎間盤內(nèi)髓核細(xì)胞的營養(yǎng)主要通過終板途徑獲得營養(yǎng)。隨著年齡逐漸增加，軟骨終板逐漸變薄、鈣化，軟骨終板的血管數(shù)量也就逐漸減少。髓核細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)相對缺乏，從而導(dǎo)致髓核細(xì)胞數(shù)量減少，最終導(dǎo)致椎間盤退變。葡萄糖是椎間盤髓核細(xì)胞的營養(yǎng)成分之一，葡萄糖是通過糖酵解的方式向椎間盤提供

2、能量的，故椎間盤需要消耗大量的葡萄糖。在椎間盤軟骨終板鈣化的情況下，軟骨終板限制了葡萄糖的通過，導(dǎo)致椎間盤髓核內(nèi)葡萄糖濃度降低，進(jìn)而導(dǎo)致髓核細(xì)胞活性降低和凋亡增加。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹荚谘芯康蜐舛绕咸烟菍w外培養(yǎng)髓核細(xì)胞形態(tài)、生長及凋亡的影響，為椎間盤退變的病因?qū)W研究提供依據(jù)。
　　一、人椎間盤髓核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　人髓核組織取自脊柱側(cè)彎矯形手術(shù)患者，年齡在10-15歲，術(shù)前MRI檢查證實(shí)椎間盤信號與正常椎間盤信號一致。所

3、取標(biāo)本在超凈臺上仔細(xì)分離出韌帶、纖維環(huán)和軟骨終板，剪碎髓核組織。0.25％的胰蛋白酶消化約40min。0.2％Ⅰ型膠原酶和0.2％Ⅱ型膠原酶混勻消化約3h，待髓核組織變成絮狀物質(zhì)后，用DF12+10％FBS終止消化。離心，去除組織殘?jiān)?，加入DF12+15％FBS培養(yǎng)液。細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；MTT法繪制細(xì)胞生長曲線；甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)；GAG和Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定細(xì)胞表型。結(jié)果：

4、GAG染色和Ⅱ型膠原染色對細(xì)胞進(jìn)行鑒定所得細(xì)胞為髓核細(xì)胞，甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)正常，MTT法繪制生長曲線顯示細(xì)胞生長良好。結(jié)論：胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶混合培養(yǎng)法所得髓核細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞生長良好，表型表達(dá)為髓核細(xì)胞，滿足椎間盤體外實(shí)驗(yàn)研究。
　　二、不同葡萄糖濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液對體外培養(yǎng)椎間盤髓核細(xì)胞形態(tài)、生長和凋亡的作用
　　實(shí)驗(yàn)中的髓核細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)一中培養(yǎng)的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為四組：加入葡萄糖濃度為5mmol/L的培

5、養(yǎng)液組(對照組)；加入葡萄糖濃度為2.5mmol/L的培養(yǎng)液組；加入葡萄糖濃度為1mmol/L的培養(yǎng)液組；加入葡萄糖濃度為0mmol/L的培養(yǎng)液組。MTT法繪制生長曲線；培養(yǎng)48h和72h后，相差顯微鏡觀察髓核細(xì)胞形態(tài)變化；透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果可以看到，隨著培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的不斷降低，細(xì)胞數(shù)量也逐漸減少。這說明過低的葡萄糖濃度細(xì)胞培養(yǎng)液可抑制髓核細(xì)胞的增殖。對照組中，細(xì)胞呈多角形或短梭形。超微

6、結(jié)構(gòu)顯示，細(xì)胞核為橢圓形，核膜完整，有1-3個大小不等的核仁。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，線粒體結(jié)構(gòu)正常。在2.5mmol/L組、1mmol/L組、0mmol/L組中，倒置顯微鏡下均可見到大量的長梭形細(xì)胞，胞質(zhì)減少，折光性減弱等細(xì)胞衰老跡象。2.5mmol/L組、1mmol/L組中，透射電鏡可觀察到髓核細(xì)胞內(nèi)大量溶酶體和脂肪滴，濃縮的核染色質(zhì)邊聚。0mmol/L中，透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化為，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目明顯減少，細(xì)胞器破壞，胞膜