角膜堿燒傷后新生淋巴管的實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、角膜堿燒傷是臨床上最常見的致盲性化學(xué)性眼外傷。盡管臨床上對早期患者行急救治療，但是仍有不少患者或因?yàn)閭麆葸^重而早期就潰瘍穿孔失明，或者因無法減輕堿燒傷后出現(xiàn)的并發(fā)癥而嚴(yán)重影響了視力。然而，部分堿燒傷的患者是因角膜堿燒傷后期需行角膜移植而排斥率卻很高，造成移植失敗而最終致盲。堿燒傷后角膜的損傷和愈合的確切機(jī)制和角膜移植的排斥機(jī)制至今仍未完全清楚。很多學(xué)者認(rèn)為角膜堿燒傷后的病理生理變化過程中免疫機(jī)制其中很重要的作用，但是傳統(tǒng)的抗免疫反應(yīng)、抗

2、新生血管的形成的各種治療的效果都并不理想。近年來角膜新生淋巴管的相關(guān)研究為角膜病理生理過程中的免疫機(jī)制的進(jìn)一步闡明帶來了曙光。新生淋巴管所起的精確作用未完全清楚。但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為角膜新生淋巴管不僅與角膜炎癥水腫的消退有關(guān)，更重要的是新生淋巴管參與了角膜的免疫反應(yīng)。新生淋巴管和角膜新生血管構(gòu)成了角膜的“免疫雙臂”，加速抗原識別來促進(jìn)了免疫反應(yīng)的發(fā)生。角膜堿燒傷后，如果出現(xiàn)角膜新生淋巴管則不僅可以通過免疫系統(tǒng)識別變性的自身角膜蛋白加劇堿燒傷

3、后早期的炎癥，引起了早期的“自體排斥”反應(yīng)；而且可以在角膜堿燒傷后期病人行角膜移植時(shí)增加了“異體排斥”的免疫反應(yīng)。有學(xué)者認(rèn)為角膜新生淋巴管還可以通過減少前房相關(guān)免疫偏離而增加了角膜的免疫排斥反應(yīng)。但是，角膜堿燒傷后是否有新生淋巴管的出現(xiàn)及新生淋巴管的數(shù)量變化有何規(guī)律，至今仍無這方面的動物實(shí)驗(yàn)研究的詳細(xì)報(bào)道，而臨床研究更是一片空白。為此，我們采用NaOH溶液制作大鼠角膜堿燒傷的模型，觀察堿燒傷后角膜新生淋巴管的動態(tài)變化，為臨床上角膜堿燒傷

4、后早期的抗新生淋巴管的治療提供理論依據(jù)和研究角膜新生淋巴管的動物模型。同時(shí)我們通過收集一組角膜堿燒傷病人行角膜移植時(shí)取下來的堿燒傷后的角膜組織，進(jìn)行新生淋巴管檢測和相關(guān)臨床資料的統(tǒng)計(jì)及其它有關(guān)的檢查，以找出人角膜堿燒傷后新生淋巴管的發(fā)生情況和臨床上的一些間接估測指標(biāo)。 第一部分：角膜堿燒傷后新生淋巴管的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究大鼠角膜堿燒傷后的角膜新生淋巴管的動態(tài)變化。 方法：制備大鼠角膜堿燒傷模型，并記錄燒傷后每天

5、的炎癥指數(shù)(inflammationindex，ID)變化；采用5'核苷酸酶-堿性磷酸酶(5'-nase-Alkalinephosphatase，5'-NA-ALP)雙重酶組織化學(xué)染色及大鼠淋巴管內(nèi)皮特異性抗體LYVE-1免疫組織化學(xué)染色定量檢測堿燒傷后6h、1d、3d、1w、2w、3w、4w、5w的角膜新生淋巴管和血管的動態(tài)變化，并進(jìn)行淋巴管計(jì)數(shù)(lymphaticvesselscounting，LVC)和血管的計(jì)數(shù)(bloodves

6、selscounting，BVC)；同時(shí)，采用常規(guī)的HE染色檢測各個時(shí)間點(diǎn)的多形核白細(xì)胞的浸潤情況，并計(jì)數(shù)PMN值；采用透射電鏡和全角膜免疫組化定性觀察各個時(shí)間段的淋巴管的局部微觀結(jié)構(gòu)和整體情況。 結(jié)果：大鼠角膜堿燒傷后早期就有新生淋巴管生成，2w末時(shí)LVC達(dá)到高峰(7.67+1.00)，以后逐漸下降，5w末時(shí)LVC基本消失，為0.33±0.50。堿燒傷引起的炎癥高峰在3d時(shí)出現(xiàn)，比新生淋巴管高峰早且無明顯的相關(guān)性(r=0.36

7、，P=0.341)。新生血管的達(dá)到高峰的時(shí)間與淋巴管一致，兩者有很好的相關(guān)性(r=0.982，P＜0.001)。 結(jié)論：大鼠角膜堿燒傷后早期就有新生淋巴管生成并隨時(shí)間動態(tài)變化，且其變化可能與炎癥和新生血管有關(guān)。 第二部分：角膜堿燒傷后新生淋巴管的臨床研究 目的：探討人角膜堿燒傷后新生淋巴管的發(fā)生情況 方法22例角膜堿燒傷后需行角膜移植的患者納入本研究，根據(jù)病史記錄每個患者的堿燒傷程度(injureddeg

8、ree，ID)和堿燒傷的時(shí)間(time，T)，并詳細(xì)觀測術(shù)前患者的燒傷眼的炎癥指數(shù)(inflammationindex，Ⅱ)，及采用計(jì)算面積軟件SCION，根據(jù)患者術(shù)前的裂隙燈照片，計(jì)算出患眼角膜新生血管的相對面積(bloodvesselsarea，BVA)。采用5'核苷酸酶-堿性磷酸酶(5'-nase-Alkalinephosphatase，5'-NA-ALP)雙重酶組織化學(xué)染色及人淋巴管內(nèi)皮特異性抗體LYVE-1和管腔內(nèi)皮非特異受體

9、CD31免疫組織化學(xué)染色定量檢測角膜新生淋巴管數(shù)目(LVC)和血管數(shù)目(BVC)；同時(shí)，采用常規(guī)的HE染色檢測各個燒傷角膜的多形核白細(xì)胞的浸潤情況，并計(jì)數(shù)PMN值；采用透射電鏡定性觀察淋巴管的局部微觀結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：雙重酶組織化學(xué)染色和免疫組化染色定量檢測22例堿燒傷病人中7例有新生淋巴管(約占32％)，檢測到的所有淋巴管腔數(shù)目(LVC=60)占所有的管腔數(shù)目(LVC+BVC=378)的16％，7例有新生淋巴管的患者均有角膜堿燒傷

10、時(shí)間T＜64M(months)。所有病例都伴隨有新生血管(BVC、BVA)和炎癥細(xì)胞的浸潤(PMN)，且它們及患者角膜堿燒傷程度(ID)、堿燒傷時(shí)間(T)、炎癥指數(shù)(Ⅱ)均與新生淋巴管(LVC)有不同程度的相關(guān)性(均有P＜0.05)。通過逐步回歸(stepwise)的方法可得到回歸方程Y=1.134X1+0.083X2(AJUSTEDR2=0.814，Y=LI，X1=Ⅱ，X2=BVA)。透射電鏡觀察堿燒傷角膜組織中存在微觀特征為管腔相對