血管抑素抑制兔角膜堿燒傷后新生血管的蛋白組研究.pdf

1、1.研究目的及意義
　　 角膜組織沒(méi)有血管的透明組織。維持其透明性的一個(gè)很重要的原因是它沒(méi)有血管。在感染、外傷、免疫反應(yīng)、排斥反應(yīng)、佩戴角膜接觸鏡、堿燒傷、基質(zhì)潰瘍、角膜緣干細(xì)胞病變等病理情況下，從角膜緣血管網(wǎng)形成的新生血管逐漸侵入角膜，從而形成角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)。誠(chéng)然，CNV在感染清除、傷口愈合等方面具有一定的積極作用。但是，CNV導(dǎo)致角膜的透明性降低，從而嚴(yán)重的影響視

2、力，另外，CNV可破壞角膜正常微環(huán)境，使眼前節(jié)生理性的免疫豁免消失，因而成為角膜移植排斥反應(yīng)的高危因素。因此，針對(duì)角膜新生血管的治療業(yè)已成為眼科的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)的研究證實(shí)，血管抑素(angiostatin，AS)存在著明確的抗角膜新生血管形成的作用，角膜上皮細(xì)胞被證明可以分泌血管抑素，但在角膜受到損傷后分泌減少。另外，血管抑素被證實(shí)通過(guò)病毒載體或者局部運(yùn)用可以抑制角膜新生血管形成。但相關(guān)作用機(jī)制研究的不足，影響著其最終運(yùn)用于臨床的進(jìn)程

3、。因此，闡明血管抑素抗角膜新生血管形成的機(jī)制，勢(shì)必為其臨床運(yùn)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
　　 2.研究方法
　　 眾所周知，蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。在蛋白質(zhì)組(proteome)概念提出以后，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究取得了可喜的發(fā)展。相比較傳統(tǒng)的只針對(duì)單一蛋白質(zhì)的研究，蛋白質(zhì)組學(xué)更加注重的是參與特定生理或病理狀態(tài)的所有蛋白質(zhì)種類及其與周圍環(huán)境（分子）的關(guān)系。隨著相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展

4、，目前已有可能對(duì)細(xì)胞在不同生理或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，相關(guān)蛋白質(zhì)的分類和鑒定，尤其是蛋白質(zhì)之間相互作用和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行探討。因此，本課題擬以堿燒傷制備的角膜新生血管為基礎(chǔ)，局部施加血管抑素，將角膜組織進(jìn)行二維電泳，分離蛋白質(zhì)并進(jìn)行染色，凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定量分析，從而明確局部施加血管抑素在抗角膜新生血管形成過(guò)程中的差異表達(dá)蛋白，進(jìn)一步地，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析，從而得到相關(guān)蛋白質(zhì)的定性數(shù)據(jù)。
　　 3.研究?jī)?nèi)容和過(guò)

5、程
　　 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:本實(shí)驗(yàn)采用的是32只新西蘭大白兔（購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組，A組為空白對(duì)照組:8只新西蘭兔不做任何處理;B組為燒傷組:12只新西蘭兔采用堿燒傷的方法建立角膜新生血管模型，術(shù)后第1天開(kāi)始局部生理鹽水點(diǎn)眼，每日3次，直至取角膜標(biāo)本;C組為治療組:12只新西蘭兔采用同樣方法建立角膜新生血管模型后，術(shù)后第1天開(kāi)始局部用30μg/ml血管抑素(AS)點(diǎn)眼，每日3次，直至取角膜標(biāo)本。

6、>　　 (2)角膜新生血管模型制作:堿燒傷法制備角膜新生血管模型:氯胺酮25mg/kg及氯丙嗪25mg/kg肌注新西蘭兔全身麻醉，0.5％丁卡因表面麻醉，置開(kāi)瞼器充分暴露眼表，將浸有1.5mol/L NaOH液的10mm圓形濾紙片置于眼表中央，1.5min后取下，用50ml生理鹽水沖洗眼表，滴妥布霉素眼液后涂妥布霉素眼膏。
　　 (3)角膜新生血管的觀察:術(shù)后觀察角膜的新生血管，第16日使用裂隙燈（蘇州66生產(chǎn) YZ5T型號(hào)）

7、照相。角膜新生血管的檢測(cè):測(cè)量血管長(zhǎng)度，以連續(xù)彎曲度小、新生血管朝向角膜混濁中心生長(zhǎng)的最長(zhǎng)血管為準(zhǔn)，并計(jì)算角膜新生血管生長(zhǎng)面積(A)，按公式A＝C/12×3.1416[r2-(r-1)2]。C為Nv累及角膜的圓周鐘點(diǎn)數(shù)，1為新生血管從角膜緣深入角膜的長(zhǎng)度，r為兔角膜半徑，設(shè)為定值7mm。
　　 (4)標(biāo)本取材及全蛋白提取:術(shù)后3w取材。標(biāo)本離體后迅速置入5ml凍存管，于液氮速凍后置入—80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ∫?0℃保存的組

8、織塊，迅速研磨至細(xì)粉末狀，加入裂解液勻漿、離心。采用Bradford定量法，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度。
　　 (6)雙向凝膠電泳(2-DE):第一向(IPG-IEF)根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同進(jìn)行等電聚焦，第二向(SDSPAGE)根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小分離樣品，雙向電泳后才用EMBL銀染。
　　 (7)圖像分析和差異蛋白選取:將銀染后的2-DE膠圖掃描入電腦。應(yīng)用ImageMaster2D軟件分析每一張凝膠圖像，計(jì)算圖譜中所有

9、蛋白質(zhì)點(diǎn)的蛋白質(zhì)相對(duì)含量，找出三塊膠中均出現(xiàn)，并且有差異的蛋白。
　　 (8)質(zhì)譜分析:切取有差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，行脫色、酶解、萃取樣品，利用美國(guó)ABI4700 MALDI—TOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。UV波長(zhǎng)為355nm，重復(fù)速率為200HZ，加速電壓為20000V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1500Da。掃描質(zhì)量范圍為700-3200Da，收集信號(hào)。胰酶自切峰為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜儀。所有實(shí)驗(yàn)樣品的質(zhì)譜圖均以用默認(rèn)模式獲得。
　　

10、(9)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索:利用軟件Mascot distiller過(guò)濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰。利用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索哺乳動(dòng)物數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時(shí)查詢其功能，來(lái)明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。
　　 查詢條件:
　　 (1)肽質(zhì)量控制在800-4000Da。
　　 (2)表觀PI與表觀Mr的誤差范圍:無(wú)限制。
　　 (3)肽片段分子量最大容許誤差控制在±50ppm。

11、　　 (4)酶解片段不完全選擇為1-2個(gè)。
　　 (5)物種來(lái)源選擇（哺乳動(dòng)物）。
　　 (6)離子選擇MH和monoisotopic。
　　 (7)固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化（Carbamidomethy1），可變修飾為蛋氨酸氧化(Oxsidation)。
　　 4.主要結(jié)果
　　 (1)成功建立兔角膜新生血管模型。
　　 (2)兔角膜堿燒傷后第16天，血管抑素作用組（C組）的新生血

12、管面積37.62±9.65mm2，對(duì)照組（B組）面積46.77±8.98mm2，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，P＜0.05，證明血管抑素對(duì)角膜新生血管有抑制作用。
　　 (3)各樣本進(jìn)行雙向電泳后，將A、C兩組與B組進(jìn)行比較，檢測(cè)到13個(gè)差異蛋白點(diǎn)。
　　 (4)差異蛋白鑒定:通過(guò)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，成功鑒定了這13個(gè)蛋白（有兩個(gè)蛋白的鑒定結(jié)果顯示為同一蛋白）。其中B組較A、C組均明顯降低的有

13、6種蛋白:白蛋白前體、熱休克蛋白A8、丙酮酸激酶、βB3-晶體蛋白、視黃醛蛋白1以及一個(gè)尚未命名的蛋白;B組較A、C組均明顯升高的有6種蛋白:網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白3、角蛋白14、肌動(dòng)蛋白11、免疫球蛋白λ鏈，免疫球蛋白κ鏈、結(jié)合珠蛋白。
　　 5.主要結(jié)論
　　 在過(guò)去的幾十年中，在腫瘤、角膜新生血管及其他新生血管性疾病中，抗血管治療通過(guò)局部運(yùn)用或者基因載體方式得到了巨大的發(fā)展，并且在這次實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)堿燒傷的兔角膜在局部

14、滴用血管抑素后，新生血管明顯減少，這就證明了血管抑素可以有效的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及增殖，并且誘導(dǎo)這些細(xì)胞凋亡。為了了解血管抑素抗血管作用的機(jī)理，通過(guò)蛋白組學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)角膜堿燒傷后局部應(yīng)用血管抑素，可以抑制燒傷后升高的蛋白，如角蛋白14、網(wǎng)鈣蛋白3、結(jié)合珠蛋白，這些蛋白都參與了新生血管的形成。血管抑素同時(shí)可以恢復(fù)燒傷后降低的蛋白，如晶體蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、白蛋白前體、丙酮酸激酶、HSPA8蛋白，這些蛋白與角膜上皮修復(fù)、能量代謝、蛋白