醛固酮調(diào)控WNK激酶家族表達及其作用機制的研究.pdf

1、前言：WNK激酶(With No lysine(K)kinaSe)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,因其家族成員在激酶功能域缺乏保守的賴氨酸而得名。WNK激酶家族成員均具有1個短的氨基端結(jié)構(gòu)域、1個高度保守的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、1個自身抑制結(jié)構(gòu)域和至少2個螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域。迄今,在人類共發(fā)現(xiàn)了該家族的4個成員,即WNK1、WNK2、WNK3和WNK4。其中,WNK1和WNK4的基因變異導致一種常染色體顯性遺傳病-Ⅱ型假性低醛固酮血癥(pseud

2、ohypoaldosteronism typeⅡ,PHAⅡ,OMIM＃145260)。PHAⅡ是一種腎臟離子轉(zhuǎn)運異常性疾病,也被稱為Gordon綜合征,主要臨床表現(xiàn)為高血壓、高血鉀和代謝性酸中毒。因此,對WNK激酶的功能研究揭示了腎臟離子轉(zhuǎn)運調(diào)控的一條新途徑。
　　 醛固酮(aldosterone,aldo)是人體內(nèi)最重要且作用最強的鹽皮質(zhì)激素,主要作用部位為腎臟,其生理作用為保鈉排鉀,調(diào)節(jié)細胞外液容量進而調(diào)控血壓。
　　

3、 由于WNK激酶家族成員與醛固酮均表達于腎臟,并且參與腎臟離子轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié),因此我們推測醛固酮可能通過調(diào)控WNK激酶家族成員的表達而發(fā)揮其生理功能。為此,我們通過體外給予大鼠醛固酮及醛固酮受體拮抗劑,高鉀飲水誘導大鼠內(nèi)源醛固酮增高;檢測各組大鼠血清醛固酮水平及血清和24小時尿液中K+、Na+、Cl-水平;Real-time PCR檢測大鼠腎臟組織WNK成員表達;檢測醛固酮刺激下WNK成員啟動子區(qū)熒光素酶報告基因活性的變化,并通過生物信息學

4、軟件分析WNK1-KS啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,以揭示醛固酮對WNK激酶家族成員的作用及其機制。
　　 材料與方法
　　 一、實驗材料與試劑
　　 1、健康雄性wistar大鼠
　　 2、總RNA提取試劑
　　 3、反轉(zhuǎn)錄試劑
　　 4、Real-time PCR試劑
　　 5、HEK293細胞系
　　 6、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑
　　 二、實驗方法
　　

5、1、48只健康雄性Wistar大鼠,隨機分為6組,每組8只,分別給予醛固酮、醛固酮受體拮抗劑和高鉀飲水。
　　 2、將大鼠置于代謝籠中飼養(yǎng),收集24小時尿液。將各組大鼠處死,采集血清,并取腎臟組織。
　　 3、提取腎臟組織RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
　　 4、Real-time PCR檢測大鼠腎臟組織中WNK基因家族成員表達。
　　 5、轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK1-L,WNK1-KS和WNK4基因啟動子熒光素酶報告基因

6、載體至HEK293細胞中,醛固酮刺激后檢測熒光素酶活性變化。
　　 6、預(yù)測WNK1-KS基因啟動子區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
　　 7、WNK1-KS啟動子區(qū)系列截短熒光素酶報告基因載體構(gòu)建及其活性檢測。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、各組大鼠血清醛同酮水平及尿液中K+水平均升高,尿Na+水平均下降;高鉀組尿Cl-水平顯著升高,其他組無變化;各組大鼠血清離子濃度均無顯著變化。
　　 2、大鼠腎臟組織

7、中WNK1-KS表達顯著上升,WNK4表達顯著下降,而WNK1-L表達無明顯變化,WNK3儀在高鉀組表達上升,在其他組無明顯變化。
　　 3、醛固酮刺激HEK293細胞后,WNK1-L啟動子區(qū)熒光素酶活性無明顯變化,WNK1-KS啟動子區(qū)熒光素酶活性顯著上升,WNK4啟動子區(qū)熒光素酶活性顯著下降。
　　 4、在WNK1-KS基因啟動子區(qū)預(yù)測到3個糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件。
　　 5、WNK1-KS啟動子區(qū)系列截短熒光素

8、酶報告基因載體轉(zhuǎn)染HEK293細胞后,pGL3-basic-975、pGL3-basic-663、pGL3-basic-150和pGL3-basic-70的轉(zhuǎn)錄活性活性顯著上升,而pGL3-basic-314、pGL3-basie-274和pGL3-basic-220的轉(zhuǎn)錄活性顯著下降。
　　 結(jié)論：
　　 醛固酮可調(diào)控WNK激酶家族成員的表達,與相應(yīng)啟動子區(qū)熒光素酶報告基因活性檢測結(jié)果一致,表明醛固酮可通過基因組效應(yīng)參