C57BL-6J-EGFP小鼠和F344大鼠胎肝干-祖細胞分離純化及定向分化潛能的研究.pdf

1、研究背景:
　　終末期肝病(End stage liver disease,ESLDs)是指各種肝臟疾病的最后階段,主要包括急性肝衰竭、慢性肝衰竭和遺傳代謝性肝病,其主要臨床表現(xiàn)為肝功能嚴重衰退及門脈高壓癥等。該病進展迅速,死亡率高。作為治療該病的最主要手段,肝移植長期以來一直受到供肝極度短缺、手術創(chuàng)傷極大、免疫排斥及免疫耐受困擾、手術費用高昂等影響,大量患者因此喪失了救治機會。以細胞為基礎的治療是一種有效的替代方法。與傳統(tǒng)肝移植

2、治療相比,肝細胞移植(Hepatocyte transplantation,HCT)具有許多優(yōu)勢,例如低侵入性、低免疫原性和可重復執(zhí)行性,這使其已經(jīng)用于治療終末期肝病。細胞移植治療終末期肝病的關鍵是細胞類型的選擇,但成體肝細胞不能保證持續(xù)擴增,加之持續(xù)灌注困難,無法大規(guī)模應用于臨床。相對于上述缺點,干細胞移植作為一種新興的治療手段為患者帶來了希望,而眾多可供選擇的干細胞中,胎肝干/祖細胞(Fetal liver stem/progeni

3、tor cells,FLSPCs)因多能性、高存活、高增殖、低免疫、小體積而優(yōu)勢明顯。要使其應用于臨床,其增殖、分化的相關機制就需要深入研究,而如果能夠穩(wěn)定大量的獲得FLSPCs,使其在體外增殖,按需分化,并能在體內(nèi)很好的示蹤,則是開展肝臟發(fā)育和臨床治療應用研究的基礎。
　　研究目的:
　　分離C57BL/6J-EGFP小鼠和F344大鼠的胎肝干/祖細胞,優(yōu)化培養(yǎng)方案得到高純度的FLSPCs,探討其自我增殖能力,及其在體內(nèi)外

4、向肝細胞和膽管細胞雙向誘導分化的潛能。
　　研究方法:
　　1.取孕13d C57BL/6J-EGFP小鼠和孕14d F344大鼠胚胎肝臟,經(jīng)膠原酶消化和機械分離獲得細胞并擴大培養(yǎng);
　　2.流式細胞術鑒定其干細胞標志物的表達;
　　3.RT-PCR及Western blot測定AFP表達;
　　4.分別將FLSPCs經(jīng)肝細胞生長因子(HGF)及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)誘導分化后,Real-time

5、PCR測量ALB、角蛋白CK-7、8、19以及Western blot測量ALB、CK-8在誘導前后的表達變化,鑒定其向肝細胞和膽管細胞雙向分化的能力;
　　5.經(jīng)尾靜脈注射FLSPCs到肝切除C57BL/6J野生型小鼠體內(nèi),觀察其在肝內(nèi)重構(gòu)肝組織的能力。
　　研究結(jié)果:
　　1.流式細胞儀檢測分離的FLSPCs表達EpCAM、CD133、CD49f等干細胞標志物;
　　2.RT-PCR和Western blot

6、檢測AFP在FLSPCs中的表達顯著高于成熟肝細胞的表達,兩者比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=8.77,5.35,P<0.05);
　　3.超低黏附培養(yǎng)皿培養(yǎng) FLSPCs克隆球形成率顯著高于同培養(yǎng)條件成熟肝細胞的克隆球形成率,兩者比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=12.71,P<0.01);體外 HGF誘導FLSPCs分化,ALB、CK-8 mRNA表達分別在8、10d到達峰值,與各自第2天比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=42.55,25.1

7、7,P<0.05);兩者蛋白表達峰值均出現(xiàn)于第10天,與各自第2天比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=175.08,41.69,P<0.05);體外 TGF-β誘導FLSPCs分化,CK-7、CK-19 mRNA在第12d達到高峰,與各自第2天比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=12.32,9.09,P<0.05);兩者蛋白表達峰值均出現(xiàn)于第14天,與各自第2天比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=53.89,39.71,P<0.05);
　　4.在移植有