轉JAK2基因調(diào)控的多潛能造血干-祖細胞體外長期擴增及定向分化實驗研究.pdf

1、第一部分 背景:造血干細胞具有自我更新和定向分化為多系成熟血細胞的能力，進行干細胞擴增一直是科學家們研究的熱點。大量的研究顯示，在不同細胞因子組合條件下所進行的懸浮和貼壁擴增培養(yǎng)體系并未獲得大量干細胞，而且存在擴增時間短等等諸多問題。 眾所周知，許多細胞的關鍵功能，比如細胞分裂分化成為特定細胞、對刺激因子的應答，甚至細胞死亡，都是通過細胞的信號和基因活化來完成的。多年來的研究證實“二聚化”是細胞內(nèi)外蛋白活化中信號轉導通路

2、的核心，是細胞分子生物學中的一般機理。當兩個蛋白發(fā)生二聚化，信號轉導就被激活。根據(jù)這些分子生物學機制，開發(fā)了基因調(diào)控表達技術，通過利用小分子化合物來控制細胞的生長，使細胞的特定信號激活或轉錄成為可能。 最近研究已經(jīng)證實，JAKs-STATs信號轉導通路在干細胞的自我更新中扮演著重要的作用，而且大多數(shù)細胞因子又是通過JAKs-STATs來傳遞信號的。JAK2是JAK家族的重要成員，在干/祖細胞的自我更新中又起著重要的樞紐性作用。因

3、此，我們構建克隆了一個以MSCV-Based的逆轉錄病毒載體，內(nèi)含有JAK2的功能信號區(qū)域和兩個對二聚化化學誘導物(AP20187)有高度親和力的結合位點(F36v)所組成。AP20187是依據(jù)藥物分子結構和蛋白質工程學設計而開發(fā)的小分子靶向基因合成藥物。該藥可以使JAK2發(fā)生二聚化同時聯(lián)合細胞因子SCF和或FL激活信號轉導通路。這項技術的應用，克服了干細胞基因治療中基因轉移率低下和基因不能有效轉導入少數(shù)干細胞的制約，而且基因調(diào)控表達技

4、術的應用能夠使我們定向分化為我們所需要的細胞和組織類型。 目的:探討JAK2轉基因骨髓造血干/祖細胞體外長期擴增調(diào)控和定向分化潛能的可行性和安全性。 方法:我們構建克隆了一個MSCV-based逆轉錄病毒載體稱作MGI-F2Jak2，它編碼一個綠色熒光蛋白(GFP)和兩個改進的FK506結合蛋白(F36v)與酪氨酸激酶JAK2組成的融合蛋白，F(xiàn)36v是二聚化化合物AP20187的高度親和力結合位點。應用該載體轉染GpE+

5、86包裝細胞株，獲得高效價病毒后轉染BaF3細胞株，表達JAK2的BaF3細胞株來測定MTT試驗。將C57BL/6小鼠的骨髓細胞與照射過的GpE+86產(chǎn)毒細胞株共培養(yǎng)48h實現(xiàn)基因轉導，轉導后的造血細胞在X-vivo15培養(yǎng)體系中擴增，分為1)空白對照組，2)AP20187組，3)SCF組，4)FL組，5)SCF+FL組，6)AP20187+SCF組，7)AP20187+FL組，8)AP20187+SCF+FL組。擴增的細胞用流式細胞儀

6、檢測免疫表型，并進行定向分化、祖細胞集落培養(yǎng)、脾集落形成單位(CFU-S)、胸腺內(nèi)注射、信號轉導抑制、IgH重排、裸鼠致瘤實驗的研究。 結果: MTT試驗顯示，在沒有IL-3條件下，AP20187仍可以支持和促使BaF3細胞株的生長。根據(jù)MTT劑量反應曲線，選定AP20187 100nmol/L為最佳實驗濃度。實驗結果表明，只有AP20187+SCF(AS)組、AP20187+FL(AF)組和AP20187+SCF+FL(ASF

7、)組獲得了轉JAK2基因骨髓造血細胞持續(xù)大量增殖，擴增80天后，細胞數(shù)達到擴增前的10<'12-19>倍，細胞平均倍增時間約30h。其中AS擴增的細胞表型為CD34、c-kit和Scal等干細胞表面標志強陽性，其它細胞表面標志如：Gr1、CD11b、TER119、CD41、B220、CD3接近陰性；AF組擴增的細胞表型為：Sca1、c-kit、IL-7、CD43、B220低至中等程度表達陽性，CD3、Gr1、TER119、CD41、Th

8、y1.1等表達陰性，AF組細胞含有B220+CD43+IgM-的祖B細胞群(Pro-B)和Lin IL-7<'+>Thy1.1<'->Scal<'low>c-kit<'low>表型的共同淋巴系祖細胞(CLPs)；而ASF組細胞具有高度的異質性，Scal陽性細胞52～98％，c-kit陽性表達56～69％，CD34陽性表達40～85％，TER119陽性占0～20％，CD41陽性占5～36％，B220陽性占12～46％，CD11b陽性占35

9、～46％，CD3表達陰性。AS和ASF所擴增的細胞在不同的細胞因子組合下，可定向分化為粒細胞、巨噬細胞、紅細胞和巨核細胞，其中AS細胞在SCF+TPO+IL-11條件下能夠明顯分化為巨核細胞。甲基纖維素半固體培養(yǎng)條件下可形成BFU-E，CFU-GM，CFU-Mix，ASF和AF細胞在IL-7條件下又可形成B細胞集落；AF細胞PCR檢測發(fā)現(xiàn)DJ而沒有VDJ重排；AF細胞胸腺內(nèi)注射可以形成CD4、CD8、CD3陽性的T細胞亞群以及Scal、

10、CD25陽性的祖T細胞(Pro-T)；擴增3月以上的細胞仍可在致死量照射過的小鼠脾內(nèi)形成CFU-S；實驗還證實抑制MAPK和P13K通路可以阻斷細胞的生長；擴增的細胞在裸鼠體內(nèi)無腫瘤形成。 結論: AP 20187聯(lián)合SCF和或FL激活JAK2介導的信號轉導，可以大量擴增造血干/祖細胞，所擴增的細胞具有定向分化的潛能。該系統(tǒng)有助于揭示干細胞生物學相關機制，并可在細胞和基因治療中得到應用。 第二部分 研究背景:臍血

11、是自體和異體移植已經(jīng)確證的造血干細胞來源。到目前為止，臍血干細胞做為一種可以替代的干細胞來源而應用于異基因干細胞移植、骨髓衰竭和遺傳免疫性疾病而逐年增加。研究證實，臍血干細胞具有自我更新，多向分化，能重建長期造血及高免疫耐受等特點和優(yōu)勢，成為基因治療最理想的靶細胞之一。但是基因轉移率低下是目前基因治療各種遺傳和獲得性血液病所面臨的主要障礙。干細胞基因轉移要達到治療性應用依賴于明顯增加干細胞基因修飾的比例。最近，很多證據(jù)證實JAK2在造血

12、干/祖細胞自我更新中扮演著重要的作用。為了克服臍血基因轉移率低下的障礙，我們根據(jù)基因調(diào)控表達技術的原理，開發(fā)了一個可以靶向擴增基因修飾的臍血CD34+細胞體系。這種方法可以特定的傳遞和激活CD34+細胞內(nèi)JAK2的信號并使轉基因的臍血CD34+細胞獲得大量擴增。 目的:探討轉基因JAK2介導的臍血干/祖細胞長期擴增調(diào)控的可行性、安全性及生物學特征。 方法:構建逆轉錄病毒載體MGI-F<,2>JAK2，內(nèi)含有JAK2基因的

13、功能催化區(qū)和兩個與小分子靶向基因合成藥物(AP20187)結合的位點蛋白(2XF36v，F(xiàn)<,2>)組成。AP20187可與F36v特異結合引起JAK2二聚化而激活細胞內(nèi)信號傳導。該載體同時含有綠色熒光蛋白報告基因(GFP)，用作檢測細胞增殖的標記。應用MiniMACS免疫磁珠分選系統(tǒng)純化分離臍血CD34+細胞，用含JAK2的逆轉錄病毒上清轉染臍血CD34+細胞。轉導后的CD34+細胞在SCF、FL、TPO、IL-6細胞因子的聯(lián)合培養(yǎng)條

14、件下，以不加或加入AP20187分別作為對照組和實驗組。定期檢測CD34+細胞基因轉移后GFP動態(tài)變化、細胞免疫標記、造血祖細胞集落培養(yǎng)、染色體核型分析和裸鼠致瘤試驗。 結果:分選的CD34+細胞純度為91％以上，基因轉導率為49.3％±6.2％；實驗組AP20187+SCF+FL+TPO+IL-6(ASFTI)與對照組SCF+FL+TPO+IL-6(SFTI)組均可獲得CD34+細胞擴增，但ASFTI組可獲得更大量增殖。隨著培

15、養(yǎng)時間的延長，實驗組擴增的CD34+細胞GFP陽性率由基線水平逐漸上升于第11周時達到95％以上，而對照組GFP陽性率逐漸下降到基線水平以下并逐漸消失。在培養(yǎng)6周左右，實驗組CD34+CD38-、CD34+CD38+細胞亞群擴增倍數(shù)分別為(228.26±32.31)、(321.48±40.52)，分別與對照組相比，差異有顯著性。于8周時細胞免疫表型檢測：CD33<'+>、CD61<'+>、Gly-A<'+>部分陽性；CD38<'+>、H