轉(zhuǎn)JAK2基因調(diào)控的多潛能造血干-祖細(xì)胞體外長期擴(kuò)增及定向分化實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 背景:造血干細(xì)胞具有自我更新和定向分化為多系成熟血細(xì)胞的能力，進(jìn)行干細(xì)胞擴(kuò)增一直是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。大量的研究顯示，在不同細(xì)胞因子組合條件下所進(jìn)行的懸浮和貼壁擴(kuò)增培養(yǎng)體系并未獲得大量干細(xì)胞，而且存在擴(kuò)增時(shí)間短等等諸多問題。 眾所周知，許多細(xì)胞的關(guān)鍵功能，比如細(xì)胞分裂分化成為特定細(xì)胞、對刺激因子的應(yīng)答，甚至細(xì)胞死亡，都是通過細(xì)胞的信號和基因活化來完成的。多年來的研究證實(shí)“二聚化”是細(xì)胞內(nèi)外蛋白活化中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

2、的核心，是細(xì)胞分子生物學(xué)中的一般機(jī)理。當(dāng)兩個(gè)蛋白發(fā)生二聚化，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)就被激活。根據(jù)這些分子生物學(xué)機(jī)制，開發(fā)了基因調(diào)控表達(dá)技術(shù)，通過利用小分子化合物來控制細(xì)胞的生長，使細(xì)胞的特定信號激活或轉(zhuǎn)錄成為可能。 最近研究已經(jīng)證實(shí)，JAKs-STATs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在干細(xì)胞的自我更新中扮演著重要的作用，而且大多數(shù)細(xì)胞因子又是通過JAKs-STATs來傳遞信號的。JAK2是JAK家族的重要成員，在干/祖細(xì)胞的自我更新中又起著重要的樞紐性作用。因

3、此，我們構(gòu)建克隆了一個(gè)以MSCV-Based的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，內(nèi)含有JAK2的功能信號區(qū)域和兩個(gè)對二聚化化學(xué)誘導(dǎo)物(AP20187)有高度親和力的結(jié)合位點(diǎn)(F36v)所組成。AP20187是依據(jù)藥物分子結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)工程學(xué)設(shè)計(jì)而開發(fā)的小分子靶向基因合成藥物。該藥可以使JAK2發(fā)生二聚化同時(shí)聯(lián)合細(xì)胞因子SCF和或FL激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，克服了干細(xì)胞基因治療中基因轉(zhuǎn)移率低下和基因不能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)入少數(shù)干細(xì)胞的制約，而且基因調(diào)控表達(dá)技

4、術(shù)的應(yīng)用能夠使我們定向分化為我們所需要的細(xì)胞和組織類型。 目的:探討JAK2轉(zhuǎn)基因骨髓造血干/祖細(xì)胞體外長期擴(kuò)增調(diào)控和定向分化潛能的可行性和安全性。 方法:我們構(gòu)建克隆了一個(gè)MSCV-based逆轉(zhuǎn)錄病毒載體稱作MGI-F2Jak2，它編碼一個(gè)綠色熒光蛋白(GFP)和兩個(gè)改進(jìn)的FK506結(jié)合蛋白(F36v)與酪氨酸激酶JAK2組成的融合蛋白，F(xiàn)36v是二聚化化合物AP20187的高度親和力結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)用該載體轉(zhuǎn)染GpE+

5、86包裝細(xì)胞株，獲得高效價(jià)病毒后轉(zhuǎn)染BaF3細(xì)胞株，表達(dá)JAK2的BaF3細(xì)胞株來測定MTT試驗(yàn)。將C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞與照射過的GpE+86產(chǎn)毒細(xì)胞株共培養(yǎng)48h實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)后的造血細(xì)胞在X-vivo15培養(yǎng)體系中擴(kuò)增，分為1)空白對照組，2)AP20187組，3)SCF組，4)FL組，5)SCF+FL組，6)AP20187+SCF組，7)AP20187+FL組，8)AP20187+SCF+FL組。擴(kuò)增的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀

6、檢測免疫表型，并進(jìn)行定向分化、祖細(xì)胞集落培養(yǎng)、脾集落形成單位(CFU-S)、胸腺內(nèi)注射、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制、IgH重排、裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)的研究。 結(jié)果: MTT試驗(yàn)顯示，在沒有IL-3條件下，AP20187仍可以支持和促使BaF3細(xì)胞株的生長。根據(jù)MTT劑量反應(yīng)曲線，選定AP20187 100nmol/L為最佳實(shí)驗(yàn)濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有AP20187+SCF(AS)組、AP20187+FL(AF)組和AP20187+SCF+FL(ASF

7、)組獲得了轉(zhuǎn)JAK2基因骨髓造血細(xì)胞持續(xù)大量增殖，擴(kuò)增80天后，細(xì)胞數(shù)達(dá)到擴(kuò)增前的10<'12-19>倍，細(xì)胞平均倍增時(shí)間約30h。其中AS擴(kuò)增的細(xì)胞表型為CD34、c-kit和Scal等干細(xì)胞表面標(biāo)志強(qiáng)陽性，其它細(xì)胞表面標(biāo)志如：Gr1、CD11b、TER119、CD41、B220、CD3接近陰性；AF組擴(kuò)增的細(xì)胞表型為：Sca1、c-kit、IL-7、CD43、B220低至中等程度表達(dá)陽性，CD3、Gr1、TER119、CD41、Th

8、y1.1等表達(dá)陰性，AF組細(xì)胞含有B220+CD43+IgM-的祖B細(xì)胞群(Pro-B)和Lin IL-7<'+>Thy1.1<'->Scal<'low>c-kit<'low>表型的共同淋巴系祖細(xì)胞(CLPs)；而ASF組細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性，Scal陽性細(xì)胞52～98％，c-kit陽性表達(dá)56～69％，CD34陽性表達(dá)40～85％，TER119陽性占0～20％，CD41陽性占5～36％，B220陽性占12～46％，CD11b陽性占35

9、～46％，CD3表達(dá)陰性。AS和ASF所擴(kuò)增的細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子組合下，可定向分化為粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞，其中AS細(xì)胞在SCF+TPO+IL-11條件下能夠明顯分化為巨核細(xì)胞。甲基纖維素半固體培養(yǎng)條件下可形成BFU-E，CFU-GM，CFU-Mix，ASF和AF細(xì)胞在IL-7條件下又可形成B細(xì)胞集落；AF細(xì)胞PCR檢測發(fā)現(xiàn)DJ而沒有VDJ重排；AF細(xì)胞胸腺內(nèi)注射可以形成CD4、CD8、CD3陽性的T細(xì)胞亞群以及Scal、

10、CD25陽性的祖T細(xì)胞(Pro-T)；擴(kuò)增3月以上的細(xì)胞仍可在致死量照射過的小鼠脾內(nèi)形成CFU-S；實(shí)驗(yàn)還證實(shí)抑制MAPK和P13K通路可以阻斷細(xì)胞的生長；擴(kuò)增的細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)無腫瘤形成。 結(jié)論: AP 20187聯(lián)合SCF和或FL激活JAK2介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以大量擴(kuò)增造血干/祖細(xì)胞，所擴(kuò)增的細(xì)胞具有定向分化的潛能。該系統(tǒng)有助于揭示干細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)機(jī)制，并可在細(xì)胞和基因治療中得到應(yīng)用。 第二部分 研究背景:臍血

11、是自體和異體移植已經(jīng)確證的造血干細(xì)胞來源。到目前為止，臍血干細(xì)胞做為一種可以替代的干細(xì)胞來源而應(yīng)用于異基因干細(xì)胞移植、骨髓衰竭和遺傳免疫性疾病而逐年增加。研究證實(shí)，臍血干細(xì)胞具有自我更新，多向分化，能重建長期造血及高免疫耐受等特點(diǎn)和優(yōu)勢，成為基因治療最理想的靶細(xì)胞之一。但是基因轉(zhuǎn)移率低下是目前基因治療各種遺傳和獲得性血液病所面臨的主要障礙。干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移要達(dá)到治療性應(yīng)用依賴于明顯增加干細(xì)胞基因修飾的比例。最近，很多證據(jù)證實(shí)JAK2在造血

12、干/祖細(xì)胞自我更新中扮演著重要的作用。為了克服臍血基因轉(zhuǎn)移率低下的障礙，我們根據(jù)基因調(diào)控表達(dá)技術(shù)的原理，開發(fā)了一個(gè)可以靶向擴(kuò)增基因修飾的臍血CD34+細(xì)胞體系。這種方法可以特定的傳遞和激活CD34+細(xì)胞內(nèi)JAK2的信號并使轉(zhuǎn)基因的臍血CD34+細(xì)胞獲得大量擴(kuò)增。 目的:探討轉(zhuǎn)基因JAK2介導(dǎo)的臍血干/祖細(xì)胞長期擴(kuò)增調(diào)控的可行性、安全性及生物學(xué)特征。 方法:構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MGI-F<,2>JAK2，內(nèi)含有JAK2基因的

13、功能催化區(qū)和兩個(gè)與小分子靶向基因合成藥物(AP20187)結(jié)合的位點(diǎn)蛋白(2XF36v，F(xiàn)<,2>)組成。AP20187可與F36v特異結(jié)合引起JAK2二聚化而激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。該載體同時(shí)含有綠色熒光蛋白報(bào)告基因(GFP)，用作檢測細(xì)胞增殖的標(biāo)記。應(yīng)用MiniMACS免疫磁珠分選系統(tǒng)純化分離臍血CD34+細(xì)胞，用含JAK2的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清轉(zhuǎn)染臍血CD34+細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后的CD34+細(xì)胞在SCF、FL、TPO、IL-6細(xì)胞因子的聯(lián)合培養(yǎng)條

14、件下，以不加或加入AP20187分別作為對照組和實(shí)驗(yàn)組。定期檢測CD34+細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移后GFP動態(tài)變化、細(xì)胞免疫標(biāo)記、造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)、染色體核型分析和裸鼠致瘤試驗(yàn)。 結(jié)果:分選的CD34+細(xì)胞純度為91％以上，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)率為49.3％±6.2％；實(shí)驗(yàn)組AP20187+SCF+FL+TPO+IL-6(ASFTI)與對照組SCF+FL+TPO+IL-6(SFTI)組均可獲得CD34+細(xì)胞擴(kuò)增，但ASFTI組可獲得更大量增殖。隨著培

15、養(yǎng)時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞GFP陽性率由基線水平逐漸上升于第11周時(shí)達(dá)到95％以上，而對照組GFP陽性率逐漸下降到基線水平以下并逐漸消失。在培養(yǎng)6周左右，實(shí)驗(yàn)組CD34+CD38-、CD34+CD38+細(xì)胞亞群擴(kuò)增倍數(shù)分別為(228.26±32.31)、(321.48±40.52)，分別與對照組相比，差異有顯著性。于8周時(shí)細(xì)胞免疫表型檢測：CD33<'+>、CD61<'+>、Gly-A<'+>部分陽性；CD38<'+>、H