低硒對F344大鼠子代神經(jīng)行為發(fā)育和海馬神經(jīng)前體細胞分化、成熟蛋白表達的影響.pdf

1、背景與目的:
　　硒是人和動物生命活動所必需的微量元素。硒缺乏會引起含硒酶活性降低,氧自由基清除受阻、內(nèi)分泌紊亂等一系列機體功能障礙,其對神經(jīng)系統(tǒng)的影響也越來越引起學(xué)者們的重視。
　　前期本課題組建立了人工膳食低硒、低碘和聯(lián)合低硒低碘喂養(yǎng)的SD大鼠動物模型,并歷時近三年繁衍至仔四代,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),仔三代、四代低硒大鼠已經(jīng)表現(xiàn)出不同程度體格和神經(jīng)發(fā)育延遲、腦內(nèi)EGFR/MAPK信號傳導(dǎo)通路有一定影響、但Morris水迷宮空間記

2、憶能力沒有明顯影響等。
　　本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上,再次通過人工低硒飼料喂養(yǎng) F344近交系大鼠復(fù)制低硒動物模型,深入細致研究其子代出生后早期不同時間點4d,7d,14d,21d的含硒酶 GPx(glutathione peroxidase,谷胱甘肽過氧化物酶)活性變化、早期神經(jīng)行為發(fā)育、子代發(fā)育期大鼠開場行為和Morris水迷宮空間記憶能力表現(xiàn)。并通過檢測腦神經(jīng)細胞形態(tài)發(fā)育、海馬神經(jīng)前體細胞標記蛋白(nestin)、增殖細胞核

3、抗原(PCNA)、膠質(zhì)細胞分化成熟蛋白――膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和2’,3’-環(huán)核甘酸3’-磷酸二酯酶(2,3- cyclic nucleotide,3-phosphodiesterase, CNPase)的表達情況,從發(fā)育,行為,功能到海馬局部形態(tài)結(jié)構(gòu)和分化、成熟蛋白的表達,進一步深入探討低硒對早期神經(jīng)發(fā)育的影響,尋找這一影響的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)。
　　方法

4、:
　　1.復(fù)制F344低硒大鼠動物模型參照本課題組已成功建立的人工膳食SD低硒大鼠模型的飼料配方,以F344純系大鼠為實驗對象建立低硒動物模型。實驗分為兩組,分別喂以不同硒碘水平的人工配制飼料:(1)合成飼料對照組(Control),硒含量0.1~0.3μg/g,碘含量≥0.2μg/g;(2)低硒組(Se-),硒含量0.02μg/g,碘含量≥0.2μg/g。
　　2. GPx活性測定改良DTNB法檢測母代和子一代P4、P7

5、、P14和P21大鼠全血中GPx活性;
　　3.檢測子一代大鼠出生后生長體重變化、生理發(fā)育指標、早期神經(jīng)行為學(xué)改變和開場行為表現(xiàn)。
　　4.Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶實驗觀察子一代大鼠尋找站臺的潛伏期、搜索策略,穿越原站臺次數(shù)、在原站臺象限停留時間等。
　　5.Nissl(甲苯胺藍)染色觀察子一代大鼠P4、P7、P14和P21海馬形態(tài)學(xué)變化。
　　6.免疫組化技術(shù)觀察生后仔鼠不同時間點(P4、P7、P14和P

6、21)海馬內(nèi)神經(jīng)前體細胞標記蛋白nestin、增殖細胞核抗原PCNA、神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化成熟相關(guān)蛋白GFAP、CNPase的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1. GPx活性:(1)母代Se-組大鼠全血GPx活性顯著低于對照組(P<0.05);(2)子一代Se-組同日齡大鼠GPx活性也顯著低于相應(yīng)對照組(P<0.05)。
　　2.早期生長發(fā)育指標的檢測:Se-組仔鼠出生后早期體重增長較對照組緩慢(P<0.05),但耳廓分離、出

7、毛、門齒萌出、睜眼及毛發(fā)發(fā)育等幾個指標與對照組比較無顯著差異。
　　3.早期神經(jīng)行為發(fā)育指標檢測中:生后4天時,Se-組仔鼠的平面翻正評分明顯較對照組低(P<0.05)、懸崖回避實驗陽性率也顯著低于對照組;7天時,兩組間無顯著性差異。P10時,Se-組仔鼠的聽覺驚愕陽性達標率低于對照組(P<0.05);在P12和P14時的前臂握力和行走能力實驗中,Se-組與對照組表現(xiàn)無顯著性差異(P﹥0.05)。開場實驗中,Se-組雄鼠在中央格停

8、留時間、穿行格數(shù)(活動能力)較對照組明顯減少,(P﹤0.05);Se-組雌鼠在開場實驗各個指標與對照組無顯著性差異。
　　4. Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶實驗:(1)潛伏期:定向航行實驗第4、5天時,Se-組潛伏期明顯長于對照組(P<0.01);兩組雌雄性別之間無顯著性差異;(2)運動策略結(jié)果:定向航行實驗第5~9時段采用直線式和趨向式為主要的尋找策略,Se-組在第6和第9時段的訓(xùn)練中所采取的直線式策略次數(shù)明顯比對照組少(P=

9、0.009; P=0.03)。(3)空間探索實驗中,Se-組在原站臺所在象限停留時間比對照組短(P<0.05)。
　　5.海馬形態(tài)學(xué)觀察:從P4~P21,海馬各分區(qū)錐體細胞層逐漸變薄,而齒狀回(DG)顆粒細胞層細胞則呈逐漸增多的趨勢。相同日齡內(nèi),與對照組相比,Se-組海馬皮層錐體細胞層較厚,齒狀回(dentate gyrus, DG)內(nèi)臂形成較晚。
　　6.海馬神經(jīng)前體細胞標記蛋白巢蛋白(nestin)和增殖細胞核抗原(PC

10、NA)免疫組化結(jié)果:總體上,從P4~P21這個發(fā)育過程中,大鼠海馬中都有nestin和PCNA抗原的表達,且兩個指標陽性總體表達趨勢比較相似,都隨日齡增加逐漸降低。陽性細胞計數(shù)和積分光密度值測量結(jié)果:(1)P4時 Se-組海馬 DG區(qū)的nestin表達較對照組多(P<0.05),其余時間點在相同海馬分區(qū),兩組間陽性表達無顯著差異。(2)PCNA陽性細胞計數(shù)結(jié)果:與對照組相比,Se-組P4~P7海馬CA1和CA3區(qū)陽性細胞數(shù)多;P21時C

11、A1和DG區(qū)陽性細胞也較對照組多((P<0.05)。
　　7.海馬膠質(zhì)細胞分化成熟相關(guān)蛋白免疫組化結(jié)果:(1)GFAP:P4海馬未見陽性細胞表達, P7時低硒組海馬 DG區(qū), P21時的DG區(qū) GFAP免疫組化積分光密度值較對照組小(P<0.05),在選取的其余發(fā)育時間點無顯著差異(P>0.05)。(2)CNPase:從P4~P7,海馬均未見CNPase陽性表達;至P14時,僅能在海馬傘、海馬槽和分子細胞層見到少量呈絲狀的弱陽性表

12、達, P21海馬低硒組和對照組海馬各區(qū)CNPase的陽性表達無顯著性差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功復(fù)制F344近交系大鼠低硒動物模型并繁殖到子一代
　　2.低硒可導(dǎo)致子一代大鼠在早期生長,神經(jīng)生理反射及神經(jīng)行為方面出現(xiàn)不同程度的發(fā)育延遲,影響雄鼠開場實驗中對新異環(huán)境的適應(yīng)能力。
　　3.低硒可導(dǎo)致子一代大鼠在Morris水迷宮的空間記憶能力減弱。
　　4.低硒能不同程度地延遲大鼠海馬形態(tài)發(fā)