仔三代低硒大鼠海馬形態(tài)發(fā)育及分化成熟相關(guān)蛋白和BDNF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的:
　　硒是人體生長發(fā)育必需的微量元素,在生命活動中有著非常重要的作用。缺硒會引起含硒酶活性降低,氧自由基清除受阻、生物膜損傷、解毒和免疫功能減退等一系列機(jī)體功能障礙。缺硒還很可能影響腦的發(fā)育。缺碘性弱智兒童的出生要求我們搞清楚在二十多年全民補(bǔ)碘后的今天,碘因素基本去除后,缺硒是否為另一個影響智力發(fā)育的重要因素?硒對神經(jīng)細(xì)胞分化發(fā)育的影響越來越引起學(xué)者們的重視。已有研究發(fā)現(xiàn):硒能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞體外存活和發(fā)育,但硒在體內(nèi)對腦

2、形態(tài)發(fā)育有什么影響?硒碘聯(lián)合缺乏的影響又如何?還未見報道。本實(shí)驗(yàn)利用已成功建立的低硒、低碘大鼠模型第三代動物,取生后第4天、21天的大腦標(biāo)本,通過HE、Nissl(甲苯胺藍(lán))、PAS染色,體視學(xué)測量、免疫組化和Western Blot蛋白免疫印跡方法對生后大鼠腦,特別是海馬的形態(tài)發(fā)育改變、神經(jīng)細(xì)胞分化成熟蛋白---膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP,星形膠質(zhì)細(xì)胞)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE,神經(jīng)元)、2’,3’-環(huán)核甘酸3磷酸二酯酶(CNP

3、ase少突膠質(zhì)細(xì)胞)以及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。
　　材料和方法:
　　利用已成功建立并繁殖至第三代的動物模型,實(shí)驗(yàn)分四組:低硒組、低碘組、低硒低碘組和對照組(補(bǔ)硒補(bǔ)碘組)。大鼠分別在生后第4天、第21天取腦。第4天的大鼠每組取4例腦標(biāo)本,固定---包埋--切片,行HE、Nissl和GFAP染色做一般普通光鏡觀察。第21天的大鼠每組取6例腦標(biāo)本,固定、包埋后切片,做HE、Nissl、PAS染色,鏡下

4、觀察并對海馬區(qū)進(jìn)行體視學(xué)的細(xì)胞測量;神經(jīng)細(xì)胞分化成熟蛋白GFAP、NSE、CNPase和BDNF行免疫組化染色;光鏡下陽性細(xì)胞記數(shù)并進(jìn)行陽性染色強(qiáng)度的圖象分析。此外,每組另取4例新鮮腦組織,提取總蛋白做Western Blot免疫印跡檢測GFAP、NSE、CNPase、BDNF蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、形態(tài)學(xué)觀察:
　　P4HE、Nissl染色切片觀察,與對照組比較,低硒組、低碘組和低硒低碘組大腦皮層的層狀結(jié)構(gòu)

5、模糊不清,海馬齒狀回(DG)內(nèi)臂細(xì)胞發(fā)育延遲呈 L型;到了P21,皮層細(xì)胞密度增加,排列擁擠,海馬各區(qū)也都存在不同程度的細(xì)胞數(shù)量增加,排列極性差,有多量糖原在細(xì)胞內(nèi)堆積。低碘和低硒低碘組的改變比低硒組明顯。
　　2、海馬體視學(xué)觀察:
　　體視學(xué)參數(shù):核體密度(Vv)、表面積密度(Sv)、形狀因子(SF)、核漿比(N/P)能夠用來評價細(xì)胞的發(fā)育成熟狀況,Vv可以衡量細(xì)胞的密度,一般數(shù)值越小說明細(xì)胞密度低,反之細(xì)胞密度越高;Sv

6、、SF是和細(xì)胞形狀相關(guān)的指標(biāo),Sv越大SF越小說明細(xì)胞的形狀越不規(guī)則,更趨多形性,反之細(xì)胞越接近圓形;N/P可以評價細(xì)胞發(fā)育狀況,分化越差,比值越高,分化越成熟越低。我們的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn):在CA1區(qū),各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,實(shí)驗(yàn)組的Vv、SF、N/P都增大,低硒低碘組最大(P<0.01),低碘組次之(P<0.05),而低硒組的SF、N/P也比對照組大(P<0.01),Vv則沒有差別。Sv參數(shù)各實(shí)驗(yàn)組和對照組比較偏小,三組中低硒組最高,低碘組

7、次之,低硒低碘最低(P<0.01)。在CA3區(qū),各實(shí)驗(yàn)組和對照組比較,實(shí)驗(yàn)組Vv、SF、N/P都增大,低硒低碘組最大(P<0.01),低碘組次之(P<0.01),低硒組也高于對照組(P<0.01);而Sv這個參數(shù),和對照比較,各實(shí)驗(yàn)組也都減小,低硒低碘最明顯(P<0.01),低碘組次之(P<0.05),低硒組相比無差異。在DG區(qū),各實(shí)驗(yàn)組和對照組比較,Vv、SF、N/P都有增大的趨勢,SF、N/P低硒低碘組最高(P<0.01),而低碘組

8、次之(P<0.01),低硒第三(P<0.01),而Vv、Sv在各組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。DG厚度和層數(shù)在低硒、低碘組都增加,比對照組增厚、增多。低硒低碘組則不明顯。結(jié)果提示低硒、低碘和硒碘聯(lián)合缺乏導(dǎo)致海馬細(xì)胞發(fā)育落后。
　　3、神經(jīng)細(xì)胞分化成熟蛋白的表達(dá)結(jié)果:
　　1)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)和陽性灰度值:在CA1、DG區(qū),對照組明顯高于其余三組(P<0.01)。在CA3區(qū),對照組比低硒組、低碘低硒組也表達(dá)增

9、高,統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(p<0.01),但與低碘組則無差異。Western Blot免疫印記結(jié)果也顯示對照組的表達(dá)高于其它組。結(jié)果提示:硒碘缺乏使星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)有下降的趨勢,低硒影響較大。2)神經(jīng)元標(biāo)記成熟蛋白NSE灰度分析:對照組陽性細(xì)胞灰度值比低碘組、低硒低碘組高(P<0.01);低硒組也高于低碘組和低硒低碘組(P<0.01)。低硒組和對照組無差異。Western Blot免疫印記結(jié)果也顯示各組之間存在差別,和免疫組化的結(jié)果相符

10、。結(jié)果提示:單純低硒對 NSE表達(dá)的影響不明顯,低碘和硒碘聯(lián)合缺乏可使NSE表達(dá)明顯下降。3)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記成熟蛋白CNPase結(jié)果觀察:CNPase陽性產(chǎn)物在各組的皮層、海馬都有分布。通過對海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞層內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞計數(shù),發(fā)現(xiàn)CNPase陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞在低碘組和低硒低碘組的數(shù)量增加,明顯較對照組、低硒組高;在皮層的陽性纖維染色深,分布范圍也較廣。結(jié)果提示:低碘和硒碘聯(lián)合缺乏可使海馬少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加,其結(jié)果可能使其與神

11、經(jīng)元的匹配不協(xié)調(diào)。從而可能抑制中樞神經(jīng)元神經(jīng)纖維的生長進(jìn)而來影響海馬錐體細(xì)胞的功能。
　　4、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的表達(dá):
　　BDNF免疫組化染色陽性產(chǎn)物在海馬、皮層和中腦都有表達(dá),在海馬本體,對照組陽性灰度強(qiáng)度明顯高于低硒組(P<0.05)和低硒低碘組(P<0.01),但和低碘組比較無統(tǒng)計學(xué)差異,DG區(qū)BDNF陽性灰度值在各組之間不存在差異。但在上述兩區(qū)低碘組灰度強(qiáng)度都高于低硒組,低硒低碘組最低;Western B

12、lot蛋白免疫印記則顯示低碘組較其它組表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)果提示:低硒影響海馬BDNF的表達(dá),硒碘聯(lián)合缺乏其表達(dá)量更低。
　　結(jié)論:
　　(1)從體視學(xué)的Vv、Sv、SF、N/P參數(shù)分析和鏡下形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)低硒、低碘和硒碘聯(lián)合缺乏都能不同程度地影響大鼠海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)育,而且,聯(lián)合缺乏還有一定的加合作用。
　　(2)低硒、低碘和硒碘聯(lián)合缺乏可使海馬神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化成熟標(biāo)記蛋白NSE、GFAP、CN

13、Pase都出現(xiàn)不同程度的改變。與對照組比較,低硒、低碘和硒碘聯(lián)合缺乏都使GFAP、NSE表達(dá)下降,低硒主要影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP的表達(dá),低碘則影響神經(jīng)元 NSE的表達(dá)。與對照組比較低碘和硒碘聯(lián)合缺乏CNPase表達(dá)升高,提示低碘能刺激少突膠質(zhì)細(xì)胞的增生。低硒則影響不明顯。
　　(3)和對照組比較,硒碘聯(lián)合缺乏引起B(yǎng)DNF在海馬表達(dá)的下降,單純低硒也使海馬的BDNF表達(dá)下降,但單純低碘影響不明顯,提示兩者可能通過不同的機(jī)制影響其