半邊蓮生物堿和山梗菜堿對內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的人臍動脈平滑肌細(xì)胞增殖作用的機(jī)制研究.pdf

1、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖是動脈硬化(atherosclerosis，AS)、原發(fā)性高血壓(primary hypertension，EH)、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)后再狹窄的病理基礎(chǔ)，因此探討抑制VSMCs增殖的藥物成為人們研究的熱點。近來的研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VEC)釋放的內(nèi)皮素(endothelin，ET)具

2、有強(qiáng)烈的縮血管作用。除了收縮血管作用外，ET還能夠激活有絲分裂原活化的蛋白激酶，刺激c-fos和c-myc的表達(dá)而使VSMCs肥大和增殖。 ET是一族生物活性多肽，目前發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)有4種形式的異型體，分別稱為ET-1、ET-2和ET-3及血管活性腸收縮物質(zhì)(Vasoactive intestinal contractor peptide，VIC)，其中生物活性以ET-1最強(qiáng)。ET與自然界存在的某些生物毒素有一定親緣關(guān)系，包括蛇

3、毒、蝎毒和蜂毒等。Sarafotoxins(SRTX)是從蛇毒中提取的一種毒素，與ET具有共同的祖基因和相似的生物學(xué)活性，一級結(jié)構(gòu)具有明顯的同源性，至少有60％～80％氨基酸同源，而且有相同的C-末端。研究證實，ET的c-末端特別是Tm21，兩個二硫鍵，氨基和羧基端，以及Asp8和Glu10的羧酸組對它的生物學(xué)活性起了重要的作用，構(gòu)成了SRTX和ET表面的“共同和基本”的生物活性位點。SRTX和ET構(gòu)成一組同源性異構(gòu)肽家族，競爭性結(jié)合相

4、同的G蛋白偶聯(lián)受體，通過IP<,3>、Ca<'2+>、鈣調(diào)蛋白激酶途徑，引發(fā)各類生物學(xué)效應(yīng)，因此可能從抗蛇毒中藥中尋找防治動脈硬化、高血壓等ET相關(guān)性疾病的藥物。 民間早就流傳抗蛇毒藥徐長卿治療高血壓的偏方，1993年，張繼峰等對抗蛇毒藥物：徐長卿、半邊蓮和七葉一支花等做了初步的研究。通過離體血管條和整體動物實驗發(fā)現(xiàn)半邊蓮和七葉一支花水提物可部分拮抗ET-1致小鼠的死亡作用，并可以抑制ET-1的縮血管和升壓效應(yīng)。王峰等對抗蛇毒

5、中藥紅背絲綢進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，紅背絲綢的醇提物、乙酸乙脂提取物和紅背絲綢單體CA-1201對ET-1致小鼠的死亡均有保護(hù)作用；可劑量依賴性地拮抗ET-1致大鼠胸主動脈的縮血管效應(yīng)；可明顯抑制ET-1引起的家兔胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性；CA-1201在一定程度可以拮抗[<'125>I]>ET-1與血管平滑肌成纖維細(xì)胞的結(jié)合。 1999年，我室胡維誠和杜艷芝等觀察了具有抗蛇毒作用的清熱解毒液(主要含半邊蓮、蚤休、赤芍、陳

6、皮等)對高脂飲食所引起的VEC損傷的保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)清熱解毒液在不降低高脂血癥大鼠血清膽固醇和甘油三酯的情況下，可減輕VEC受損，同時使VEC合成和釋放ET-1減少，在一定程度上起到保護(hù)VEC的作用。本課題組進(jìn)而分別提取半邊蓮有機(jī)酸和生物總堿，以及蚤休皂甙，發(fā)現(xiàn)半邊蓮生物總堿能通過拮抗ET-1合成與釋放，明顯緩解高脂血癥對血管內(nèi)皮的繼續(xù)損傷并可顯著抑制高脂血癥大鼠主動脈中膜VSMCs增殖。提示半邊蓮生物總堿可能是半邊蓮生藥中的有效成分。

7、 為了進(jìn)一步探討半邊蓮對VSMCs增殖的抑制機(jī)制，并進(jìn)一步明確其有效成分，我們提取半邊蓮生物堿(Lobelia Chinensis Lour Alkaloid，LCLA)，并同時應(yīng)用其主要單體山梗菜堿，作用于ET-1誘導(dǎo)的VSMCs增殖模型，明確其對VSMCs的作用，并探討其作用機(jī)制，為半邊蓮及其有效成分應(yīng)用于臨床治療心血管病提供實驗依據(jù)。本實驗分四個部分對此進(jìn)行了研究： 第一部分：建立內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的人臍動脈平滑肌細(xì)胞

8、增殖模型： 原代培養(yǎng)人臍動脈平滑肌細(xì)胞(human umbilical arterial smooth musclecells，HUASMCs)，α-actin單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)檢測證明培養(yǎng)的是平滑肌細(xì)胞。描繪生長曲線觀察不同劑量的ET-1對HUASMCs生長的影響以確定ET-1的作用時間和作用濃度。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的HUASMCs中分組加入不同濃度的ET-1后，第1天各組之間沒有明顯差異(P>0.05)；第2天，各濃度ET組的HU

9、ASMCs數(shù)量開始明顯增多，并隨著ET-1濃度的增加，HUASMCs增殖明顯加快，與對照組比較有明顯差異(P>0.05)，100nM、1000nM的ET-1能明顯促進(jìn)HUASMCs增殖，與10 nM的ET-1比較差異顯著(P<0.01)，但在100nM、1000nM濃度之間比較沒有明顯差異(P>0.05)；第5天，各濃度組的ET-1促進(jìn)HUASMCs增殖達(dá)到最大值，與對照組差異顯著(P<0.01)，100nM、1000riM濃度的ET

10、-1與10 nM濃度的ET-1比較差異顯著(P<0.01)，但兩者之間比較沒有差異(P>0.05)。由此我們確定ET-1的作用濃度為100nM，作用時間為24h。然后我們以ETAR特異性拮抗劑BQ-123和PKC特異性抑制劑星形孢菌素(Staurosporine，ST)作為陽性對照，采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測100nM ET-1作用HUASMCs 24h后對其生長的影響，以建立ET-1誘導(dǎo)的HUASMCs增殖模型。研究結(jié)果顯示

11、：ET-1可明顯增加HUASMCs內(nèi)的吸光度值，表明細(xì)胞的數(shù)目增加，增殖活性增強(qiáng)(P<0.01)；1000nM BQ-123和100 nM ST均可抑制ET-1所誘導(dǎo)的HUASMCs增殖(P<0.01)，增殖抑制率分別為33.3±0.5％和25.6±0.8％。 由此證明，100nM的ET-1與HUASMCs共同孵育24h后能顯著促進(jìn)HUIASMCs增殖，可作為研究血管平滑肌細(xì)胞增殖的模型。 第二部分：半邊蓮生物堿和山梗菜堿

12、對內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的人臍動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響： 提取LCLA充分溶解于DMSO中，分別配制成各濃度組LCLA溶液。首先采用臺盼蘭染色排斥實驗檢測不同濃度DMSO的細(xì)胞毒性，以排除DMSO對實驗結(jié)果的影響。實驗發(fā)現(xiàn)DMSO濃度小于0.125％時對mJASMCs無細(xì)胞毒性作用，本實驗中所用液體DMSO終濃度低于0.1％，可以排除DMSO對結(jié)果的影響。為分析LCLA溶液和山梗菜堿溶液的細(xì)胞毒性我們?nèi)圆捎门_盼藍(lán)染色排斥實驗和檢測培養(yǎng)液

13、的乳酸脫氫酶(1actatedehydrogenase，LDH)含量方法。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組、50、100、200、400μg/mL 的LCLA組和10、30、100、300μM的山梗菜堿組細(xì)胞生長良好，形態(tài)正常，無細(xì)胞脫失區(qū)，無細(xì)胞碎片。臺盼藍(lán)染色排斥實驗顯示，上述組細(xì)胞存活率均大于95％，上清液LDH含量差異無顯著性(P>0.05)。而600μg/mL的LCLA組和500μM的山梗菜堿組細(xì)胞變圓，許多細(xì)胞失去突起，細(xì)胞

14、碎片多，細(xì)胞數(shù)目明顯減少甚至消失脫落。臺盼藍(lán)染色排斥實驗顯示，上述組細(xì)胞存活率均小于50％，上清液LDH含量明顯高于對照組(P<0.05)。然后我們將50、100、200、400μg/mL的LCLA和10、30、100、300μM的山梗菜堿與100nM的ET-1共同作用于HUASMCs，24h后采用CCK-8試劑盒計數(shù)細(xì)胞篩選LCLA和山梗菜堿的實驗用劑量。發(fā)現(xiàn)50μg/mL的LCLA組和10μM的山梗菜堿組細(xì)胞數(shù)目與ET組比較無明顯

15、差異，100、200、400μg/mL的LCLA組和30、100、300μM的山梗菜堿組細(xì)胞數(shù)與ET組比較有顯著性差異(P<0.05)，且隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少。因此我們推斷LCLA和山梗菜堿的作用濃度分別為100～400μg/mL和30～300μM。將上述濃度組藥物以及1000nM BQ-123、100 nM ST與100nM的ET-1共同作用于HUASMCs，24h后采用<'3>H-TdR摻入、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測增殖

16、細(xì)胞核抗原素(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達(dá)水平觀察它們對ET-1誘導(dǎo)的HUASMCs增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)ET-1使HUASMCs<'3>H-TdR摻入量和PCNA的表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.01)，而ET+LCLA、ET+山梗菜堿、ET+BQ-123和ST均可降低<'3>H-TdR摻入量和下調(diào)HUASMCs的PCNA的表達(dá)率(P<0.05)，并且LCLA和山梗菜堿的抑制作用具

17、有濃度依賴性。 因此我們得出結(jié)論：ET-1可明顯促進(jìn)HUASMCs增殖。100～400μg/mL的LCLA、30～300μM的山梗菜堿、ETAR特異性拮抗劑BQ-123和PKC特異性抑制劑ST均可抑制ET-1所誘導(dǎo)的HUASMCs增殖，LCLA和山梗菜堿的抑制作用具有濃度依賴性，且此抑制作用并非是通過細(xì)胞毒性作用實現(xiàn)的。 第三部分：半邊蓮生物堿、山梗菜堿對內(nèi)皮素-1 誘導(dǎo)的人臍動脈平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程的影響： 本

18、文第二部分的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LCLA及其單體山梗菜堿可濃度依賴性地抑制ET-1誘導(dǎo)的HUASMCs增殖，而細(xì)胞最終通過細(xì)胞周期來完成其分裂、增生，細(xì)胞周期是被一系列細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶(Cyelin-dependent kinases，CDKs)、細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子(Cyclin-kinase inhibitor，CKI)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)調(diào)控來實現(xiàn)。其中CyclinD<,1>是細(xì)胞周期中G<,1>/S期轉(zhuǎn)變

19、的關(guān)鍵點，p21<'WAF1/CIP1>能抑制多種CDK或Cyclin-CDK的活性，所以本部分通過流式細(xì)胞儀觀察LCLA及其單體山梗菜堿對ET-1誘導(dǎo)的HUASMCs細(xì)胞周期的改變，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)半定量檢測CyclinD<,1>和p21 <'WAF1/CIP1>mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確LCLA和山梗菜堿拮抗ET-1，抑制HUASMCs增殖的作用機(jī)制。將不同濃度的LCLA (100、200、400μg/mL)、山

20、梗菜堿(30、100、300μM)和1000nM BQ-123、100 nM ST與100 nM ET-1共同培養(yǎng)HUASMCs 24h后，流式細(xì)胞儀顯示ET-1刺激HUASMCs由靜止期(G<,0>/G<,1>期)進(jìn)入DNA合成期(S期)和有絲分裂期(G<,2>/M期)，其中G<,0>/G<,1>期細(xì)胞比例顯著低于對照組(P<0.01)，而S期與G<,2>/M期細(xì)胞顯著高于對照組(P<0.01)。LCLA、山梗菜堿、BQ-123和ST

21、均顯著緩解ET-1所致的變化(P<0.05)，LCLA和山梗菜堿具有一定的濃度依賴性。RT-PCR結(jié)果為：與對照組相比，ET-1促使CyclinD<,1> mRNA的表達(dá)量明顯增加，p21<'WAF1/CIP1>mRNA的表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。與ET組相比，LCLA、山梗菜堿、BQ-123和ST均使CyclinD<,1>mRNA的表達(dá)量減少，p21<'WAF1/CIP1>mRNA的表達(dá)量增多，且隨著LCLA和山梗菜堿濃度的增高

22、，作用逐漸增強(qiáng)。因此認(rèn)為ET-1通過推進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展發(fā)揮促HUASMCs增殖作用；BQ-123、ST、LCLA(100～400μg/mL)和山梗菜堿(30～300μM)拮抗ET-1所誘導(dǎo)的HUASMCs增殖機(jī)制不是由HUASMCs凋亡所導(dǎo)致的，而是通過抑制CyclinD<,l> mRNA的表達(dá)，促進(jìn)p21<'WAF1/CIP1>mRNA的表達(dá)，使ET-1促進(jìn)的細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，而發(fā)揮拮抗ET-1的促HUASMCs增殖作用；ETAR和P

23、KC激活均可推動細(xì)胞周期的進(jìn)展。 第四部分：半邊蓮生物堿、山梗菜堿對內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的人臍動脈平滑肌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)通路的影響： 本實驗的前三部分證實ET-1促HUASMCs增殖的作用與ETAR和PKC有關(guān)，LCLA和山梗菜堿都呈濃度依賴性地抑制ET-1的促HUASMCs增殖作用。Ca<'2+>作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使可激活PKC，是觸發(fā)細(xì)胞增殖相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的始動因素。因此為進(jìn)一步研究LCLA和山梗菜堿抗增殖的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機(jī)制

24、，在本部分我們采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)cE<'2+>濃度的改變，并采用RT-PCR方法檢測LCLA和山梗菜堿對ETAR mRNA和PKCα mRNA的表達(dá)。不同濃度的LCLA(100、200、400μg/mL)、山梗菜堿(30、100、300μM)和1000nM BQ-123、100 nM ST與100 nM ET-1共同培養(yǎng)HUASMCs 24h后，負(fù)載Fluo-3，在488nm波長的光激發(fā)下，可觀察到ET-1孵育引起HUASM

25、Cs內(nèi)游離cE<'2+>濃度明顯高于正常組(P<0.01)，ET+LCLA組、ET+山梗菜堿組、ET+BQ-123組、ET+ST組VSMC的Ca<'2+>濃度均顯著低于ET組(P<0.05)。動態(tài)觀察HUASMCs內(nèi)的Ca<'2+>熒光顯示，100 nM ET-1刺激細(xì)胞游離Ca<'2+>呈雙相變化：先快速增加到峰值，峰值熒光變化之后迅速下降并維持于平臺期。分別加入200 μg/mL的LCLA、100μM山梗菜堿、1000nM BQ-1

26、23、100 nM ST預(yù)孵育5min后，再加入100 nM ET-1，HUASMCs內(nèi)Ca<'2+>熒光強(qiáng)度上升到峰值的幅度減小，平臺期與靜息Ca<'2+>熒光強(qiáng)度之間的變化也小于ET組(P