小麥紋枯病菌效應(yīng)因子的分離及功能研究.pdf

1、小麥紋枯病也被稱之為小麥尖眼斑病(Wheat Sharp Eyespot)，是一種發(fā)生普遍并嚴(yán)重危害小麥生產(chǎn)的土傳性真菌病害。現(xiàn)今該病已成為威脅小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要限制因素，因此加強(qiáng)對(duì)該病害的研究力度已十分必要。
　　禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis Van der Hoeve n）是引起小麥紋枯病的主要病原菌。小麥紋枯病菌根據(jù)菌絲融合情況劃分為不同的菌絲融合群（anastomosis group，簡(jiǎn)稱AG）。其

2、中禾谷絲核菌AG-D群和立枯絲核菌(AG-4和AG-5菌絲融合群)均可引起小麥紋枯病，我國(guó)小麥紋枯病的主要致病菌群是禾谷絲核菌的AG-D群，約占90％以上。
　　效應(yīng)因子（Effector）是植物原核和真核病原菌所分泌的一類蛋白質(zhì)分子，該類蛋白質(zhì)分子可改變寄主植物的防御機(jī)制使病原菌增強(qiáng)對(duì)寄主植物的感染，還可以調(diào)控病原菌的侵染過程，利于其在寄主體內(nèi)的生長(zhǎng)和繁殖。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展以及對(duì)植物病原菌的深入研究，效應(yīng)因子已經(jīng)成為現(xiàn)今研究

3、病原菌與寄主植物互作分子機(jī)制的重要內(nèi)容。至今，對(duì)禾谷絲核菌效應(yīng)因子的發(fā)現(xiàn)和研究還尚未見到相關(guān)的報(bào)道。在本研究中我們從禾谷絲核菌中克隆到了一個(gè)能夠誘發(fā)小麥產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)（HR）的效應(yīng)因子，經(jīng)NCBI,SMART數(shù)據(jù)庫比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶家族（Glyeosyltransferas amily2，GT-2），有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道糖基轉(zhuǎn)移酶是一類效應(yīng)因子，本研究初步證明該基因確實(shí)是一個(gè)與小麥紋枯病菌致病性密切相關(guān)的效應(yīng)因子，這可為研究禾

4、谷絲核菌與寄主小麥互作分子機(jī)制提供一定的理論參考。
　　本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.小麥紋枯病的接種及侵染過程
　　運(yùn)用牙簽嵌入接種法使強(qiáng)致病力禾谷絲核菌菌株WK207侵染感紋枯病小麥溫麥6，觀察禾谷絲核菌的侵染過程及小麥病情的動(dòng)態(tài)發(fā)展變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種72 h小麥的葉鞘部位開始出現(xiàn)微小的肉眼可見的病斑，接種7d在葉鞘部位可明顯的觀察到典型的中間灰白色，四周褐色的近圓形或橢圓形小麥紋枯病病斑，接種10 d葉鞘

5、部位已變黃壞死。掃描電鏡結(jié)果顯示禾谷絲核菌菌株WK207侵染小麥可從傷口部位侵入，直接穿透侵入和通過氣孔侵入。在侵染過程中可形成侵染墊，侵染釘?shù)惹秩窘Y(jié)構(gòu)。
　　2.小麥?zhǔn)芎坦冉z核菌侵染后ROS及C asp as e3-li ke的變化
　　選取接種12、24、48、72、96 hpi（hours post inoculation）及5、6、7、8、9、10 dpi（days post inoculation）檢測(cè)溫麥6體內(nèi)R

6、OS（O2-和H202）的產(chǎn)生和Caspase3-like活性的變化。結(jié)果表明，O2-的含量在接種12 h已達(dá)到很高，隨著病斑的擴(kuò)大，染色逐漸加深，在發(fā)病后期即接種9-10 d葉鞘和莖稈均被染為深藍(lán)色。受禾谷絲核菌WK207侵染，溫麥6體內(nèi)的H202在接種48 h出現(xiàn)第一個(gè)峰值，隨著病情的逐步發(fā)展，H202的產(chǎn)量增多，染色愈漸加深，且主要集中在發(fā)病部位，在接種9-10d出現(xiàn)另一個(gè)高峰。溫麥6體內(nèi)Caspase3-like在受禾谷絲核菌W

7、K207侵染的12 h，36 h和72 h分別有三個(gè)活性高峰，且在72 h活性最高。
　　3.禾谷絲核菌菌株R0301和WK207候選效應(yīng)因子的克隆
　　我們參考已經(jīng)報(bào)道的立枯絲核菌候選效應(yīng)因子的基因序列后，從禾谷絲核菌菌株R0301和WK207中克隆到了候選效應(yīng)因子，經(jīng)生物信息學(xué)軟件比對(duì)后證明該基因?qū)儆贕T-2，其中R0301候選效應(yīng)因子大小為1056bp，WK207候選效應(yīng)因子大小為1038bp，均含有signal pe

8、ptide。
　　4.禾谷絲核菌候選效應(yīng)因子的原核表達(dá)
　　對(duì)上述候選效應(yīng)因子構(gòu)建載體后進(jìn)行原核表達(dá)，R0301所編碼的氨基酸為351個(gè)，翻譯38kDa大小的蛋白，該蛋白的等電點(diǎn)為8.099；WK207所編碼的氨基酸為345個(gè)，翻譯37kDa大小的蛋白，該蛋白的等電點(diǎn)為7.18；將菌體破碎后可得到候選效應(yīng)因子的粗蛋白，過層析柱后可得到純的融合蛋白。
　　5.禾谷絲核菌候選效應(yīng)因子的功能驗(yàn)證
　　將上述融合蛋白涂抹