抗結(jié)核桿菌降解性多肽文庫(kù)的構(gòu)建與篩選.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的慢性消耗性人畜共患病，嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物的健康。宿主可以通過(guò)激活細(xì)胞免疫與體液免疫殺傷Mtb，然而Mtb也進(jìn)化出多種機(jī)制逃避宿主的殺傷作用。研究表明，一些Mtb的分泌蛋白和非分泌蛋白可以通過(guò)與宿主蛋白的相互作用影響細(xì)胞內(nèi)吞噬溶酶體形成、自噬以及抗原遞呈等生理過(guò)程，干擾宿主細(xì)胞對(duì)其的清除，從而持續(xù)存活于細(xì)胞內(nèi)。然而，對(duì)如何有效的降解這些抗原蛋白

2、卻知之甚少。
　　本研究以Mtb中CFP-10、ESAT-6、Ag85b和HspX蛋白為研究對(duì)象，以酵母雙雜交技術(shù)和一套包含自噬分子伴侶介導(dǎo)區(qū)（Chaperone-mediated autophagy， CMA）、蛋白綁定域（Protein bind domain，PBD）以及細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPP）的降解系統(tǒng)為基礎(chǔ)，以期篩選出能與這些結(jié)核蛋白具有高親和力的多肽，利用這些多肽的綁定功

3、能綁定靶蛋白，并借助穿膜肽提高滲透細(xì)胞膜的效率和在分子伴侶介導(dǎo)的自噬作用下將目標(biāo)蛋白靶向溶酶體腔進(jìn)行降解。為研發(fā)新型抗結(jié)核病藥物提供新的思路和基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容主要有：
　　1.利用腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）為載體表達(dá)結(jié)核抗原蛋白免疫小鼠，產(chǎn)生特異抗體。首先，將表達(dá)四個(gè)蛋白的融合基因連接至pAAV-CMV-GFP真核表達(dá)載體，利用AAV包裝系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝，測(cè)得毒價(jià)為108 FFU/mL，免疫小

4、鼠后分離出血清檢測(cè)到特異性應(yīng)答抗原的抗體。
　　2.互補(bǔ)決定區(qū)3（complementary determining region3，CDR3）的擴(kuò)增。根據(jù)CDR3兩端FR3和FR4相對(duì)保守的堿基序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以免疫后小鼠外周血cDNA為模板，成功擴(kuò)增出CDR3。經(jīng)檢測(cè)CDR3序列多樣性良好，可用作后期建庫(kù)。
　　3.包含CFP-10、ESAT-6、Ag85b和HspX四個(gè)抗原蛋白Bait文庫(kù)的構(gòu)建。首先擴(kuò)增這四個(gè)抗原片

5、段，自激活檢測(cè)結(jié)果顯示均不表現(xiàn)出自激活。接著分別將這些片段與線性化pGBKT7載體共轉(zhuǎn)化進(jìn)Y2H細(xì)胞，構(gòu)建含有這四個(gè)抗原的Bait文庫(kù)。
　　4.以CDR3為“獵物”基因構(gòu)建Prey多肽文庫(kù)。通過(guò)摸索文庫(kù)構(gòu)建的條件，確定CDR3片段與pGADT7線性化載體質(zhì)量以1:10的比例轉(zhuǎn)化Y187細(xì)胞，庫(kù)容量可達(dá)到106。由于CDR3來(lái)源的抗體是經(jīng)過(guò)免疫，可以特異性應(yīng)答CFP-10、ESAT-6、Ag85b和HspX這幾個(gè)抗原蛋白，所以以此