EGS文庫(kù)構(gòu)建與反向遺傳篩選的研究.pdf

1、核酸酶P(RNaseP)是一種核蛋白復(fù)合物，它主要識(shí)別和切割前體tRNA的前導(dǎo)序列以產(chǎn)生成熟形式的tRNA。RNaseP具有兩個(gè)獨(dú)特的特性：它是所有生物體內(nèi)含量最多、最穩(wěn)定、最有效的核酸酶：它的誘導(dǎo)反應(yīng)機(jī)制取決于對(duì)靶標(biāo)RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的識(shí)別，而不是依賴于對(duì)靶標(biāo)RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的識(shí)別。由兩個(gè)核酸分子組成并具有類(lèi)tRNA結(jié)構(gòu)的復(fù)合物可被RNaseP特異地識(shí)別和切割，該復(fù)合物中的其中一個(gè)小分子RNA被稱為EGS(ExternalGuideSequ

2、ence，外指引序列)。EGS誘導(dǎo)RNaseP對(duì)其靶標(biāo)RNA進(jìn)行識(shí)別和切割，但不會(huì)導(dǎo)致非靶標(biāo)RNA被降解。EGS的靶標(biāo)特異性由以下兩種分子間相互作用所決定：EGS的靶標(biāo)配對(duì)區(qū)域與靶標(biāo)RNA中的靶標(biāo)區(qū)域的堿基互補(bǔ)作用；靶標(biāo)RNA與EGS的類(lèi)tRNA結(jié)構(gòu)(相當(dāng)于tRNA中的“T-stem”、“T-loop”和“VailiableRegions”結(jié)構(gòu))的相互作用?！?/4EGS”衍生于大腸桿菌的酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNATyr)，其效能已被大

3、量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所驗(yàn)證?！?/4EGS”由靶標(biāo)配對(duì)序列(與靶標(biāo)RNA的靶標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì))和RNaseP識(shí)別序列(部分天然tRNA序列)所組成。 基于RNA文庫(kù)的反向遺傳篩選、突變篩選以及基因敲除等研究使1500多個(gè)秀麗隱桿線蟲(chóng)基因與表型建立聯(lián)系。但秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組中20000多個(gè)預(yù)測(cè)基因中大部分基因的功能有待研究。不同研究者利用RNAi文庫(kù)對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行反向遺傳篩選所獲取的結(jié)果存在較大差異。即使同一研究者采用同樣的實(shí)驗(yàn)步驟，各

4、次實(shí)驗(yàn)間的RNAi篩選結(jié)果仍有10％～30％的變異性。這要求建立新的反向遺傳篩選工具以推動(dòng)秀麗隱桿線蟲(chóng)的反向遺傳篩選。 本文在驗(yàn)證EGS技術(shù)可用于干擾秀麗隱桿線蟲(chóng)的基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)和構(gòu)建了EGS文庫(kù)，并驗(yàn)證其對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行了反向遺傳篩選的有效性。 秀麗隱桿線蟲(chóng)的綠色熒光蛋白(gfp)轉(zhuǎn)基因株(PD4251)中具有兩種綠色熒光蛋白，一種是具有核定位信號(hào)的綠色熒光蛋白(Ngfp)--由Ngfp-lacZmRNA編碼

5、，另外一種是具有線粒體定位信號(hào)的綠色熒光蛋白(Mtgfp)--由MtgfpmRNA編碼。 本文選擇Ngfp-lacZmRNA和MtgfpmRNA作為EGS的靶標(biāo)mRNA，以驗(yàn)證EGS技術(shù)用于干擾秀麗隱桿線蟲(chóng)基因表達(dá)的可行性。在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件的輔助下，以“3/4EGS”為設(shè)計(jì)框架設(shè)計(jì)了靶向Ngfp-lacZmRNA的EGS-Ngfp-lacZ和靶向MtgfpmRNA的EGS-Mtgfp。EGS-Ngfp-lacZ和EGS-

6、Mtgfp的表達(dá)框被分別克隆至pET28a表達(dá)載體以構(gòu)建pET28a-EGS-Ngfp-lacZ和pET28a-EGS-Mtgfp。pET28a-EGS-Ngfp-lacZ為含有EGS-Ngfp-lacZ表達(dá)框的重組載體，其EGS-Ngfp-lacZ表達(dá)框至于T7終止子和T7啟動(dòng)子的控制下；pET28a-EGS-Mtgfp為含有EGS-Mtgfp表達(dá)框的重組載體，其EGS-Mtgfp表達(dá)框至于T7終止子和T7啟動(dòng)子的控制下。分別以pET

7、28a-EGS-Ngfp-lacZ和pET28a-EGS-Mtgfp為模板，PCR擴(kuò)增EGS-Ngfp-lacZ-IVTT和EGS-Mtgfp-IVTT，以分別作為EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp的體外轉(zhuǎn)錄模板。利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，對(duì)EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp進(jìn)行制備。EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp被單獨(dú)或共同導(dǎo)入PD4251中。以“SoakingBuffer”處理的PD4251作為對(duì)照，

8、EGS-Ngfp-lacZ或EGS-Mtgfp單獨(dú)處理的PD4251的熒光強(qiáng)度有所下降，但EGS-Ngfp-lacZ和EGS-Mtgfp共同處理的PD4251的熒光強(qiáng)度明顯下降。為了驗(yàn)證熒光強(qiáng)度的下降是由上述EGS誘導(dǎo)RNaseP對(duì)其相應(yīng)靶標(biāo)RNA進(jìn)行識(shí)別和切割所導(dǎo)致的，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(QPCR)對(duì)GFPmRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分析；GFPmRNA的表達(dá)水平是Ngfp-lacZmRNA和MtgfpmRNA的表達(dá)水平的代表。與“

9、SoakingBuffer”處理的PD4251的GFPmRNA的表達(dá)水平相比，EOS-Ngfp-lacZ或EGS-Mtgfp處理的PD4251的GFPmRNA表達(dá)水平分別下降了32±4.3％和37±5.2％。EGS-Ngfp-lacZ和EGS±Mtgfp共同處理的PD4251的GFPmRNA表達(dá)水平下降了93±3.6％。為了進(jìn)一步驗(yàn)證EGS-Ngfp-1acZ和EGS-Mtgfp對(duì)其靶標(biāo)的干擾效力，利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westernbl

10、ot)分析了Ngfp蛋白和Mtgfp蛋白的表達(dá)水平。與“SoakingBuffer”處理的PD4251的Ngfp蛋白和Mtgfp蛋白的表達(dá)水平相比，EGS-Ngfp-lacZ處理的PD4251的Ngfp蛋白的表達(dá)水平降低了54±5.1％，但Mtgfp蛋白的表達(dá)水平僅降低了4±6.3％。EGS-Mtgfp處理的PD4251的Mtgfp蛋白的表達(dá)水平降低了64±3.8％，但Ngfp蛋白的表達(dá)水平僅降低了6±3.3％。EGS-Ngfp-lae

11、Z和EGS-Mtgfp共同處理的PD4251的Ngfp和Mtgfp蛋白的表達(dá)水平分別降低了67±5.6％，94±2.8％。 以“3/4EGS”為設(shè)計(jì)框架對(duì)EGS文庫(kù)(LEGS)進(jìn)行設(shè)計(jì)。EGS文庫(kù)的設(shè)計(jì)如下：“3/4EGS”的靶標(biāo)配對(duì)區(qū)域由隨機(jī)堿基組成；在“CCA”序列的5’末端添加“UUU”序列以提供EGS的穩(wěn)定性。EGS文庫(kù)的表達(dá)框被克隆至pET28a表達(dá)載體以構(gòu)建pET28a-LEGS。pET28a-LEGS為含有EGS文

12、庫(kù)表達(dá)框的重組載體，其EGS文庫(kù)表達(dá)框至于T7終止子和T7啟動(dòng)子的控制下。把pET28a-LEGS轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中以篩選pET28a-EGS-clone。pET28a-EGS-clone為含有EGS文庫(kù)中某一特定表達(dá)框的重組載體，這一表達(dá)框至于T7終止子和T7啟動(dòng)子的控制下。為了檢驗(yàn)EGS文庫(kù)的克隆效率及其EGS表達(dá)框的組成是否符合理論設(shè)計(jì)，隨機(jī)挑取pET28a-EGS-clone進(jìn)行限制性內(nèi)切酶分析、測(cè)序分析及比對(duì)分析。

13、 上述分析結(jié)果表明本文構(gòu)建的EGS文庫(kù)并不存在傾向性克隆，其EGS表達(dá)框的組成基本滿足理論設(shè)計(jì)。 隨機(jī)挑取EGS對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行反向遺傳篩選，以驗(yàn)證EGS文庫(kù)對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行反向遺傳篩選的有效性。以pET28a-EGS-clone為模板，PCR擴(kuò)增EGS的體外轉(zhuǎn)錄模板--EGS-clone-IVTT；以EGS-clone-IVTT為模板，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄對(duì)EGS進(jìn)行制備；把EGS導(dǎo)入各齡期的秀麗隱桿線蟲(chóng)野生株N2中；記錄P0

14、代和F1代的異常表型--不育、子代不育、產(chǎn)卵少、幼蟲(chóng)生長(zhǎng)緩慢、幼蟲(chóng)滯育、幼蟲(chóng)死亡、成蟲(chóng)死亡、形態(tài)異常、肥胖、細(xì)長(zhǎng)、麻痹、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)。其中約有6％EGS能夠誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲(chóng)的表型發(fā)生異常變化，如：幼蟲(chóng)生長(zhǎng)緩慢，幼蟲(chóng)滯育，成蟲(chóng)死亡，和不育。對(duì)能夠誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲(chóng)產(chǎn)生異常表型的EGS的靶標(biāo)mRNA進(jìn)行鑒定。通過(guò)BLAST分析以及RNAi表型與EGS誘導(dǎo)產(chǎn)生的異常表型的比較分析，EGS-35，EGS-83的靶標(biāo)mRNA被初步鑒定為ZK858.7