長穗偃麥草和大米草全長cDNA文庫的構(gòu)建與耐逆基因篩選.pdf

1、玉米是第一大糧食作物，能在不同的土壤條件和氣候條件下種植。我國0.67億公頃耕地中鹽漬化土壤約占10％，但是玉米的耐鹽能力比較低，當(dāng)鹽度大于17mmol·L-1時，50％以上的植物生長受到抑制。鹽脅迫會引起玉米產(chǎn)量的降低。因此，研究玉米對鹽脅迫的響應(yīng)及其耐鹽機制，對于玉米耐鹽性改良具有非常重要的意義。然而，作為淡土植物的玉米，其耐鹽機制非常復(fù)雜，耐鹽性狀常表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量遺傳性狀。采用常規(guī)育種或分子育種手段提高玉米耐鹽性收效甚微。

2、通過外源基因漸滲或轉(zhuǎn)基因途徑，利用野生耐鹽植物基因資源創(chuàng)制耐鹽玉米種質(zhì)是提高玉米耐鹽性的關(guān)鍵。目前，已有通過轉(zhuǎn)基因途徑提高玉米耐鹽性的報道。耐鹽轉(zhuǎn)基因植物培育的一般做法是根據(jù)人們對植物耐鹽機制的認(rèn)識，挑選少數(shù)被認(rèn)為與耐鹽相關(guān)的基因進行操作，需要花費多年時間才能獲得轉(zhuǎn)基因植株，并且經(jīng)常出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株目標(biāo)性狀表現(xiàn)不明顯，甚至與預(yù)期結(jié)果不一致的現(xiàn)象。這種做法的缺點是周期長、效率低，不能突破現(xiàn)有知識的框架。為了快速、高效篩選、應(yīng)用野生植物中的耐

3、鹽基因資源，本試驗選擇耐鹽性較強的淡土植物—長穗偃麥草(Lophopyrum elongatum L.)和耐鹽性超強的鹽生C4植物——大米草(Spartina anglica Hubb)為材料，提取了不同濃度的NaCl和PEG-6000、不同處理時間下的幼苗RNA并等量混合。采用改良的SMART技術(shù)合成雙鏈cDNA后，用Gateway方法將cDNA文庫重組到植物轉(zhuǎn)基因雙元載體pMDC83，并將長穗偃麥草和大米草cDNA文庫分別導(dǎo)入玉米或

4、煙草BY-2細(xì)胞中，初步建立了快速篩選并挖掘植物耐鹽基因的技術(shù)平臺。主要結(jié)果如下:
　　分別以100、200、300、400mmol·L-1的NaCl和20％、30％、50％(w/v)的PEG-6000處理長穗偃麥草幼苗ld、3d、5d、7d，用5％(w/v) NaCl處理大米草幼苗1d、3d、5d、7d，分別提取RNA后等量混合為總RNA。采用改良的SMART(switchingmechanism at5'end of RNA

5、transcript)方法合成全長cDNA后，用Gateway技術(shù)中的BP反應(yīng)構(gòu)建了長穗偃麥草和大米草全長入門cDNA文庫，滴度分別為4.0×106cfu·mL-1和4.3×106cfu·mL-1，重組率均達(dá)98％以上。再采用LR反應(yīng)，分別將兩個入門文庫重組到植物轉(zhuǎn)基因雙元載體pMDC83中，獲得目標(biāo)文庫。長穗偃麥草和大米草的目標(biāo)文庫原始滴度為6.0×106cfu·mL-1和5.7×106cfu·mL-1，插入片段平均長度均為0.45k

6、b，重組率均達(dá)100％。從兩個目標(biāo)文庫中各隨機挑取5個陽性克隆進行測序，并將測序結(jié)果在NCBI上進行BLASTX比對，發(fā)現(xiàn)其中3個長穗偃麥草陽性克隆的插入片段分別與植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞壁水解酶、衰老相關(guān)蛋白等有較高程度的相似性，但是其余7個序列未比對到相似序列。
　　采用本實驗室建立的農(nóng)桿菌侵染萌發(fā)花粉再授粉的方法，將長穗偃麥草和大米草cDNA目標(biāo)文庫導(dǎo)入玉米，獲得了轉(zhuǎn)基因玉米T0代種子。通過對T0代玉米種子的GFP熒光信號

7、的觀察、潮霉素抗性檢測和PCR驗證，證明外源基因成功導(dǎo)入玉米。
　　用農(nóng)桿菌侵染法將農(nóng)桿菌與煙草BY-2細(xì)胞共培養(yǎng)，將長穗偃麥草目標(biāo)文庫轉(zhuǎn)入煙草BY-2細(xì)胞中，在培養(yǎng)基中加入25mg·L-1潮霉素和濃度分別為50mmol·L-1、100mmol·L-1和200mmol·L-1的NaCl對其進行篩選，在50mmol·L-1、100mmol·L-1的鹽濃度下初步獲得耐鹽細(xì)胞系169個，而200mmol·L-1 NaCl的鹽濃度下沒有發(fā)