沙冬青低溫脅迫全長cDNA文庫構(gòu)建及AmDHN和AmRD22基因的克隆.pdf

1、沙冬青是我國西北荒漠區(qū)唯一的常綠闊葉灌木，具有很強(qiáng)的抗寒和抗旱等抗逆特性。為了發(fā)掘其抗寒基因并探討其抗寒性分子機(jī)理，本論文以蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）為材料，用SMART技術(shù)構(gòu)建了其在低溫脅迫下的全長cDNA文庫，對文庫中的部分克隆進(jìn)行了5’端測序和序列分析，并在此基礎(chǔ)上克隆了兩個抗逆相關(guān)基因的cDNA。主要研究結(jié)果如下：
　　1.所構(gòu)建的原始文庫滴度為9.44×106pfu/mL，重組率為9

2、8.3％；擴(kuò)增文庫滴度為1.98×1010pfu/mL；插入片段長度在0.5~2.5Kb，多數(shù)接近或超過1kb。這些結(jié)果表明文庫的質(zhì)量較高。
　　2.利用PCR方法從文庫中挑選出3000個陽性克隆，將其中480個克隆進(jìn)行5’端測序，得到438條有效EST序列，經(jīng)拼接獲得46個Contig和302個Singlet，合計(jì)348個Unigene。
　　3.將Unigene進(jìn)行blastx比對，有215條可被已知或推測功能的同源基因

3、所注釋，其中包括冷誘導(dǎo)蛋白、脫水素、類甜蛋白、防御素、金屬硫蛋白、蛋白酶抑制劑、ABA誘導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等逆境應(yīng)答相關(guān)蛋白的編碼基因。功能未知的新基因有133個。
　　4.以文庫中獲得的脫水素基因（AmDHN）全長cDNA序列為基礎(chǔ)，用PCR方法擴(kuò)增到其完整編碼框cDNA片段，并將其構(gòu)建到植物表達(dá)載體p3301上，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，目前已獲得T2代轉(zhuǎn)基因植株。
　　5.以本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中獲得的AmRD2