抗除蟲(chóng)菊酯單鏈抗體文庫(kù)的構(gòu)建與篩選.pdf

1、除蟲(chóng)菊酯，包括除蟲(chóng)菊酯Ⅰ-Ⅱ、瓜葉菊酯Ⅰ-Ⅱ、茉酮菊酯Ⅰ-Ⅱ，是從除蟲(chóng)菊(Chrysanthemum cinerariaefolium)干花中提取出來(lái)的一種高效、低毒、廣譜、低殘留的天然殺蟲(chóng)劑。目前，國(guó)際上大量分析鑒定除蟲(chóng)菊酯的方法，包括氣相色譜GC、液相色譜HPLC等，設(shè)備要求高，操作嚴(yán)格，前處理復(fù)雜，不適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。免疫分析方法因其具有測(cè)試費(fèi)用低、可現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有前景的檢測(cè)方法。
　　 重組抗體，包括F

2、ab，scFv，F(xiàn)v，VHH等，是一種新型的免疫檢測(cè)試劑，具有親和力高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)限低，易于在原核系統(tǒng)中大量表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。目前，抗除蟲(chóng)菊酯的重組抗體尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，研究抗除蟲(chóng)菊酯的重組抗體對(duì)建立免疫學(xué)檢測(cè)方法或開(kāi)發(fā)生物傳感器都具有十分重要的意義。本研究結(jié)合重疊PCR和差減噬菌體展示構(gòu)建了抗除蟲(chóng)菊酯的scFv文庫(kù)，并進(jìn)行初步篩選，為后續(xù)免疫方法研究奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 ①通過(guò)優(yōu)化重疊PCR擴(kuò)增抗除蟲(chóng)菊酯的單鏈抗

3、體DNA文庫(kù)。以除蟲(chóng)菊酯6種單體的混合抗原免疫BALB/c小鼠制備抗血清，用間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到105以上；分離脾細(xì)胞，提取mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，用PCR分別擴(kuò)增VH(380 bp)和VL(660 bp)可變區(qū)片段；通過(guò)Linker加端和重疊PCR組裝成抗除蟲(chóng)菊酯的長(zhǎng)鏈(780 bp)和短鏈scFv基因(750 bp)。
　　 ②利用噬菌體展示構(gòu)建抗除蟲(chóng)菊酯的長(zhǎng)、短鏈scFv抗體文庫(kù)。通過(guò)SfiⅠ位點(diǎn)將scF

4、v基因與pComb3H載體連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，獲得陽(yáng)性克隆，庫(kù)容分別達(dá)到了1.3×107和2.6×107；利用輔助噬菌體VCSM13進(jìn)行超感染，獲得抗除蟲(chóng)菊酯噬菌體文庫(kù)滴度分別達(dá)到了1×1012和7.5×1012 cfu。
　　 ③采用4輪連續(xù)篩選富集抗除蟲(chóng)菊酯的噬菌體抗體文庫(kù)。對(duì)長(zhǎng)、短鏈?zhǔn)删w文庫(kù)分別進(jìn)行4輪梯度篩選，測(cè)定文庫(kù)回收率分別得到了50和44倍的富集，并用ELISA對(duì)篩選效果進(jìn)行檢測(cè)；用Bst NI

5、限制性酶對(duì)最后一輪富集的抗體文庫(kù)進(jìn)行指紋分析，長(zhǎng)、短鏈抗體文庫(kù)的多樣性約為40～50％。
　　 ④利用噬菌體ELISA篩選抗除蟲(chóng)菊酯6種單體的單克隆抗體。從最后一輪篩選文庫(kù)中分別挑取96個(gè)單克隆進(jìn)行噬菌體抗體上清的培養(yǎng)，用ELISA分別篩選抗除蟲(chóng)菊酯6種單體的單克隆；從長(zhǎng)鏈文庫(kù)中篩選到了25個(gè)特異性結(jié)合除蟲(chóng)菊酯的單克隆，其中，3和5個(gè)克隆特異性結(jié)合除蟲(chóng)菊酯Ⅰ-Ⅱ；5和7個(gè)克隆特異性結(jié)合瓜葉菊酯Ⅰ-Ⅱ；7和3個(gè)克隆特異性結(jié)合茉酮菊