蓖麻毒素和相思子毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備及其定值分析與快速檢測技術(shù).pdf

1、蓖麻毒素（ricin toxin，RT）和相思子毒素(abrin toxin，AT)是兩個結(jié)構(gòu)和功能類似的植物毒素，具有毒性強、來源廣、易制備等特點，是生物武器核查清單中唯一的兩種植物蛋白毒素，也是重要的生物恐怖劑之一。面對防生物戰(zhàn)和反生物恐怖的迫切需求，蓖麻、相思子毒素的快速檢測和防治已成為一個研究熱點，為此，本論文開展了兩種毒素蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其定值與快速檢測方法的研究。
　　第一，針對毒素蛋白的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立一種高效親和介質(zhì)與

2、凝膠過濾柱相結(jié)合的蓖麻和相思子毒素簡便的純化與制備方法，并對純化后毒素進行特征鑒定與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值分析。
　　首先，選取了云南、新疆等不同產(chǎn)地的蓖麻和相思子種子，種子去殼后勻漿抽提，經(jīng)硫酸銨沉淀提取粗毒液，隨后利用可高效特異結(jié)合毒素與凝集素的半乳糖殘基親和介質(zhì)直接純化粗毒液，去除粗毒液中的所有雜蛋白，再將去除雜蛋白的粗毒液上樣到凝膠過濾柱，利用分子量的差異將毒素與凝集素分離，收集蓖麻毒素或相思子毒素部分，最后獲得了各產(chǎn)地天然蓖麻、相

3、思子毒素純化物，經(jīng)12％ SDS-PAGE分析RT與AT的純度均在95％以上，RT、AT的分子量大小分別約為64 kDa、65 kDa。
　　其次，對純化后的天然毒素進行特征分析。N-端測序結(jié)果顯示各產(chǎn)地毒素序列一致，而蛋白熱穩(wěn)定試驗結(jié)果表明各產(chǎn)地毒素結(jié)構(gòu)無差異，但在質(zhì)譜鑒定結(jié)果中，新疆產(chǎn)地的RT和云南產(chǎn)地的AT分值最高，因此作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物。RT和AT標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)HPLC鑒定，其純度均達95％以上，經(jīng)SMMC-7721細(xì)胞毒性試

4、驗測定，蓖麻毒素細(xì)胞CT50為2.35±0.26 ng/ml，而相思子毒素CT50達到0.0032±0.0012 ng/ml;小鼠毒性試驗結(jié)果顯示蓖麻毒素小鼠LD50大約為15μg/kg，相思子小鼠LD50約為5.3μg/kg。
　　此外，將鑒定后的毒素溶液1 mL/瓶分裝凍干，RT分裝180瓶，AT分裝120瓶。然后對RT、AT標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行定值分析，包括測定蛋白的絕對含量、均一性和穩(wěn)定性。利用高效液相色譜(HPLC)與電感耦合等

5、離子體串聯(lián)質(zhì)譜(ICP-MS)方法，通過對兩種毒素蛋白質(zhì)中的硫元素測定，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的絕對定量并可將蛋白質(zhì)的含量結(jié)果溯源到國際SI單位。經(jīng)HPLC/ICP-MS測定，蓖麻毒素含量為25.01μg/瓶，不確定度為2.77μg/瓶，且均一性良好，抽檢11瓶樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)僅為4.06％;相思子毒素定量為46.79μg/瓶，不確定度為4.66μg/瓶，均一性良好，RSD為4.81％;且兩種毒素穩(wěn)定性良好，-80℃存放6個月均可以保持

6、良好的活性。
　　第二，針對兩種毒素的檢測，利用單克隆與多克隆抗體，結(jié)合金標(biāo)記技術(shù)研制了蓖麻、相思子毒素的單重與雙重快速免疫層析檢測卡，并結(jié)合表面增強拉曼光譜技術(shù)建立了相思子毒素的毛細(xì)自驅(qū)動微流控芯片檢測方法。
　　首先，經(jīng)兔多克隆抗體和鼠單克隆抗體的組合優(yōu)化，以抗RT兔多克隆抗體為捕獲抗體，抗蓖麻毒素A鏈(RTA)單抗為檢測抗體，研制出金標(biāo)記的快速免疫層析檢測卡，純RT樣本的檢測靈敏度為16 ng/mL，特異性好，與結(jié)構(gòu)相

7、近的AT以及BSA、SEB等無關(guān)毒素蛋白均無交叉反應(yīng)，在檢測牛奶、果汁、餅干等模擬樣本時，其靈敏度仍保持不變，RT檢測卡的長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，室溫條件下有效期達12個月;同樣，利用抗AT兔多克隆抗體與抗相思子毒素A鏈(ATA)單克隆抗體組合，結(jié)合金標(biāo)記技術(shù)，研制出AT的膠體金免疫層析檢測卡，其純毒素樣本檢測靈敏度可達3 ng/mL，特異性良好，與結(jié)構(gòu)相近的RT以及BSA、SEB等無關(guān)毒素蛋白也均無交叉反應(yīng)，檢測食品模擬樣本時獲得了同

8、樣的靈敏度，室溫條件下可穩(wěn)定存放12個月。
　　其次，在RT、AT單重檢測卡的基礎(chǔ)上，以抗RT類毒素兔多抗和單抗為捕獲抗體，抗AT單抗和抗RT類毒素兔多抗為檢測抗體，首次研制了可同時檢測蓖麻與相思子毒素的膠體金免疫層析雙重檢測卡。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雙重檢測卡檢測PBS中的蓖麻毒素、相思子毒素及2種毒素混合樣本時，靈敏度均可達25 ng/mL，而檢測食品模擬樣本時，靈敏度為50 ng/mL，與單重檢測卡相比，具有同樣良好的特異性。RT、

9、AT雙重檢測卡成本更加低廉，還可減少現(xiàn)場檢測攜帶裝備數(shù)量，為戰(zhàn)時使用提供了便利。
　　此外，利用微機械與微電子技術(shù)(MEMS)設(shè)計加工的硅基片部分上的開放式微柱陣列結(jié)構(gòu)，開發(fā)了一種毛細(xì)自驅(qū)動微流控芯片，具有與硝酸纖維素膜相似的液體毛細(xì)驅(qū)動作用。然后，采用雙抗體夾心法的原理結(jié)合表面增強拉曼光譜技術(shù)(SERS)，將抗AT類毒素兔多抗分別包被于硅基片與外源性拉曼分子上，建立了基于SERS的微流控芯片快速檢測技術(shù)，檢測相思子毒素的靈敏度達

10、到0.1ng/mL，是傳統(tǒng)相思子膠體金免疫層析試紙條的30倍。
　　通過上述研究，我們建立了RT、AT戰(zhàn)劑毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，完成了RT、AT標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值分析，研制了蓖麻、相思子毒素膠體金免疫層析單重、雙重檢測卡，前者檢測靈敏度介于3～16 ng/mL，后者檢測靈敏度介于25～50 ng/mL，利用表面增強拉曼光譜技術(shù)，還首次建立了相思子毒素的毛細(xì)自驅(qū)動微流控芯片檢測方法，檢測靈敏度高達0.1ng/mL，是膠體金免疫層析檢測