蓖麻毒素免疫檢測(cè)方法的建立及RTB的融合表達(dá)與抗原性分析.pdf

1、蓖麻毒素(RT)是一種核糖體失活蛋白,由A、B鏈組成,小鼠LD50僅為7-10μg/kg。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蓖麻毒素的研究多為用于抗腫瘤的免疫毒素的制備以及中毒機(jī)理的研究,由于蓖麻毒素的毒性高,從攝入到死亡僅需1～2h,致死量極小,感官無(wú)法辨認(rèn),蓖麻毒素類毒素和抗毒素正在研究中,目前尚無(wú)用于人的特效藥,因此,蓖麻毒素的快速檢測(cè),特別是在被人體攝入之前就能夠高效靈敏的檢測(cè)到,就顯的極為重要。 本試驗(yàn)將制備的抗蓖麻毒素腹水單抗純化后進(jìn)行抗

2、原表位的分析,結(jié)果顯示4D8、4D12、1H4三株單抗的抗原決定簇均位于蓖麻毒素A鏈上。對(duì)4D8標(biāo)記了辣根過氧化物酶和FITC,基于表面等離子共振儀與流式細(xì)胞儀分析后,分別建立了夾心ELISA、IMS-ELISA、SPR與液態(tài)芯片檢測(cè)蓖麻毒素的方法。 1.夾心ELISA檢測(cè)蓖麻毒素方法的最佳條件為：45ug/ml抗RT的多克隆抗體為捕獲抗體、1:4000倍稀釋的HRP-4D8為檢測(cè)抗體、5％脫脂乳+2％PEG20000為封閉劑,

3、洗去檢測(cè)抗體后用TMB在37℃下顯色20min,測(cè)定OD450;該方法不跟與蓖麻毒素結(jié)構(gòu)相近的其它幾種毒素發(fā)生交叉反應(yīng),最低檢出濃度為5ng/ml,線性范圍為0.1-1ug/ml,對(duì)純凈水的回收率為107.6％。 2.IMS-ELISA檢測(cè)蓖麻毒素方法的最佳條件為：將多抗與磁珠偶連并封閉后用PBST緩沖液懸浮在EP管中,加入抗原后37℃輕微振蕩孵育1h,每15min吹打重懸一次,清洗后加入4000倍稀釋的HRP-4D8檢測(cè)抗體2

4、00μl孵育,清洗后加TMB底物在37℃下顯色20min,測(cè)定OD450;該方法不跟與蓖麻毒素結(jié)構(gòu)相近的其它幾種毒素發(fā)生交叉反應(yīng),最低檢出濃度為50ng/ml,當(dāng)RT濃度介于0.2-10ug/ml之間時(shí),呈現(xiàn)極好的線性關(guān)系,對(duì)純凈水、秋梨膏、純牛奶的回收率分別為95％、93％、68％。 3.由SPR動(dòng)力學(xué)分析了四株抗蓖麻毒素單抗的親和性：并建立了SPR檢測(cè)蓖麻毒素與相思子毒素的SPR檢測(cè)方法,對(duì)蓖麻毒素的線性范圍為0-2000n

5、g/ml之間,最低檢出濃度為0.05ng/ml,對(duì)相思子毒素的線性范圍為250ng/ml-2000ng/ml,最低檢出濃度為0.5ng/ml。對(duì)兩種毒素的混合物同時(shí)檢測(cè)時(shí)與單獨(dú)檢測(cè)的效果一樣。 4.本研究同時(shí)基于流式細(xì)胞儀與微球載體建立了對(duì)蓖麻毒素的檢測(cè)方法,對(duì)蓖麻毒素的線性范圍為10-1000ng/ml之間,最低檢出濃度小于0.1ng/ml。 5.采用PCR法擴(kuò)增出蓖麻毒素B鏈基因,并將其與pMD18-T克隆載體相連接