凋亡誘導(dǎo)因子與未成熟腦缺氧缺血性損傷的關(guān)系.pdf

1、目的 新生兒缺氧缺血(HI)性腦損傷是導(dǎo)致新生兒死亡以及兒童傷殘的重要原因之一，發(fā)病機(jī)理復(fù)雜涉及多個(gè)方面，其中包括自由基損傷、半胱天冬酶(caspase)激活以及凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的釋放和核轉(zhuǎn)移等。本實(shí)驗(yàn)探討AIF下調(diào)以及聯(lián)合應(yīng)用自由基清除劑伊達(dá)拉奉(3-甲基-1苯基-2-吡唑啉-5-酮)對未成熟腦缺氧缺血性損傷的影響。 對象 (1)觀察HI對雄性野生型(Wt)小鼠與Hq小鼠腦損傷情況：9日齡雄性Wt小鼠(n

2、=33)，同日齡雄性Hq小鼠(n=37)，HI 72h后進(jìn)行腦損傷程度評估。(2)觀察伊達(dá)拉奉對wt小鼠與Hq小鼠腦損傷保護(hù)情況：9日齡wt小鼠中對照組(n=16)及伊達(dá)拉奉治療組(n=17)，9日齡Hq小鼠中對照組(n=17)及伊達(dá)拉奉治療組(n=16)，HI后72h后進(jìn)行腦損傷程度的評估。 (3) 觀察鈣蛋白酶與半胱天冬酶-3活性：同日齡的Wt小鼠與Hq小鼠，HI24h后的Wt小鼠與Hq小鼠各6只，進(jìn)行腦組織勻漿，進(jìn)行免疫印跡和半胱

3、天冬酶活性測定。(4)wt小鼠對照組和伊達(dá)拉奉治療組各6只，Hq小鼠對照組和伊達(dá)拉奉治療組各6只，HI后3h．24 h灌注取腦，進(jìn)行免疫組化染色。 方法 1、新生小鼠HI腦損傷動物模型制備：生后9天新生小鼠結(jié)扎左側(cè)頸總動脈并吸入濃度10.0﹪的氧氣45min。 2、給藥方法和藥物劑量：在動脈結(jié)扎后與缺氧后分別即刻經(jīng)腹腔注射伊達(dá)拉奉注射液(10mg/kg)或相同體積的生理鹽水作對照。 3、腦組織病理學(xué)檢查

4、：HI后3h，24h，72h，灌注后取出腦組織，固定后常規(guī)脫水、包埋，連續(xù)切片，進(jìn)行微管相關(guān)蛋白2(microtubule．a(chǎn)ssociated protein 2，MAP2)、硝基酪氨酸(Nitrotysine)、4-羥壬烯醛(4-HNE)的表達(dá)檢測。 4，HI后半胱天冬酶．3與胞襯蛋白測定： HI 24h后的Wt小鼠與Hq小鼠對照組、治療組各6只，分別取雙側(cè)大腦半球勻漿，熒光分光光度法測定半胱天冬酶一3活性；免疫印跡法測定

5、胞襯蛋白含量，觀察鈣蛋白酶與半胱天冬酶-3活性。 5、伊達(dá)拉奉治療后半胱天冬酶-3，硝基酪氨酸測定：Wt小鼠對照組與治療組各5只,Hq小鼠對照組與治療組各7只，HI 24 h后斷頭處死小鼠，大腦分左右半球進(jìn)行超聲勻漿，用熒光分光光度法測定半胱天冬酶-3活性、蛋白印跡測定硝基酪氨酸含量。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用Students t-test方法檢驗(yàn)，用StatView 5．0軟件處理。

6、P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1．大腦皮層、海馬、紋狀體和丘腦在HI后均可見梗塞灶。Hq小鼠腦損傷情況較Wt小鼠減輕。 2．雄性Hq小鼠腦梗塞體積(6．55±0．99mm<'3>)比雄性Wt小鼠腦梗塞體積(13．82±1．86mm<'3>)減少了52．6﹪。 3．Hq小鼠與Wt小鼠在HI后腦組織胞襯蛋白免疫印跡顯示半胱天冬酶-3、鈣依賴蛋白酶的激活無明顯差別。 4．Hq小鼠HI后3h硝基