嬰幼兒未成熟肺缺血再灌注損傷的特點(diǎn)、機(jī)制與保護(hù)研究.pdf

1、肺缺血再灌注導(dǎo)致的損傷常見(jiàn)于外科臨床，尤以應(yīng)用體外循環(huán)(CPB)技術(shù)的各類(lèi)手術(shù)及肺移植術(shù)后最為突出。術(shù)后肺功能障礙對(duì)患者的預(yù)后有著不容低估的影響，成為影響CPB術(shù)后恢復(fù)的非心血管并發(fā)癥的首要因素。尤其是在嬰幼兒先心病手術(shù)后，此類(lèi)損傷已成為直接影響術(shù)后轉(zhuǎn)歸的最主要因素。對(duì)其發(fā)生機(jī)制的研究和尋求有效的防治措施是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外心血管外科共同關(guān)注的重要課題。研究者們致力于采用各種手段(如白細(xì)胞濾過(guò)、缺血預(yù)適應(yīng)等)及藥物干預(yù)(如糖皮質(zhì)激素、氧自由基

2、清除劑、蛋白酶抑制劑以及中藥等)來(lái)預(yù)防或減輕肺缺血再灌注損傷，雖取得一定的效果，但這些方法對(duì)嬰幼兒未成熟肺損傷的保護(hù)作用并不顯著，相關(guān)方面的研究亦少見(jiàn)報(bào)道。因此，有必要對(duì)此類(lèi)急性肺損傷病理生理過(guò)程進(jìn)行再認(rèn)識(shí)；積極探索未成熟肺損傷的特點(diǎn)；尋求進(jìn)一步的、針對(duì)性的保護(hù)方法；以此達(dá)到改善嬰幼兒體外循環(huán)術(shù)后肺功能及患者預(yù)后的目的；從而提高應(yīng)用體外循環(huán)技術(shù)各類(lèi)手術(shù)效果，特別是對(duì)嬰幼兒先心病手術(shù)治療水平具有重大意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道

3、，在大量前炎性細(xì)胞因子TNF-a、IL-1β及ROS等通過(guò)炎性細(xì)胞表面TOLL受體將刺激信號(hào)傳遞到胞漿后，髓核細(xì)胞分化因子MyD88在調(diào)控其下游的炎癥信號(hào)分子表達(dá)中起著非常關(guān)鍵的作用；并直接影響到靶組織中炎癥細(xì)胞的進(jìn)一步活化和趨化及靶組織中炎癥反應(yīng)的程度。缺血再灌注導(dǎo)致ROS的過(guò)度釋放，并由此引起的氧化應(yīng)激、線粒體功能下降是缺血再灌注肺損傷的主要病理機(jī)制?；钚宰罡?、危害最大的是羥自由基(HO)(ie，ROS-HR)，其主要作用靶標(biāo)是含有

4、大量不飽和脂肪酸的生物膜。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的終末產(chǎn)物，其含量代表了生物膜不飽和脂肪酸氧化損傷的程度。同樣，GSH-PX和SOD作為細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，可以反映細(xì)胞生物膜的保護(hù)能力。依達(dá)拉唪(Edaravone，MCI-186)是一種新型自由基清除劑，它可抑制由H2O2和Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞損傷因子OH，可明顯對(duì)抗由羥自由基及鐵離子引起脂質(zhì)過(guò)氧化的活性；可抑制水楊酸的羥化作用，與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)而顯示出對(duì)。OH的清除作用，從而顯示出其

5、強(qiáng)大的清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用。 由以上分析我們提出本研究的科學(xué)假說(shuō)：(1)在缺血再灌注所致未成熟急性肺損傷中炎癥反應(yīng)是其最主要的損傷機(jī)制，MyD88作為炎癥反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上較上游的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子，通過(guò)激活下游的NF-κB進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)水平，影響肺組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。(2)在炎癥反應(yīng)引起肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷過(guò)程中，ROS對(duì)線粒體的損傷是核心，而依達(dá)拉唪通過(guò)清除自由基，減輕ROS對(duì)線粒體的作用，改善肺泡Ⅱ型上皮細(xì)

6、胞損傷情況，最終保護(hù)未成熟肺的功能。 針對(duì)以上科學(xué)假說(shuō)，在本研究工作中，我們選用了成年(5-6月)和嬰幼兒(15-21天)新西蘭白兔，建立在體單肺缺血再灌注損傷模型；ELISA法檢測(cè)缺血再灌注過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)的IL-1β、TNF-a水平；術(shù)畢收集肺組織分別進(jìn)行MDA，ROS-HR濃度及SOD，GSH-PX活性測(cè)定； Western blot檢測(cè)MyD88和NF-κB水平；并提取肺組織中的線粒體，行膜電位(△ψm)、腫脹率及游離鈣水

7、平測(cè)定；光鏡和電鏡分別觀察肺組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變。比較、分析成年組與嬰幼兒組缺血再灌注損傷過(guò)程中生化、免疫、病理變化特點(diǎn)和規(guī)律；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了氧自由基清除劑依達(dá)拉唪(Edaravone)預(yù)處理對(duì)未成熟肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。 第一部分成年兔與嬰幼兒兔肺缺血再灌注損傷的比較研究 目的：通過(guò)成年兔與嬰幼兒兔肺缺血再灌注損傷的比較研究，探討嬰幼兒兔未成熟肺損傷的特點(diǎn)及其可能的機(jī)制。 方法：選

8、用成年(5-6月)和嬰幼兒(15-21天)新西蘭白兔各24只，分別隨機(jī)配到成年對(duì)照組、成年缺血再灌注組、嬰幼兒對(duì)照組、嬰幼兒缺血再灌注組。建立Sakuma單肺缺血再灌注模型，肺門(mén)阻斷1h后，開(kāi)放再灌注4h。收集各時(shí)間點(diǎn)的血樣，ELISA法檢測(cè)IL-1β、TNF-a水平；術(shù)畢收集肺組織分別進(jìn)行MDA，ROS-HR濃度及SOD，GSH-PX活性測(cè)定；Westem blot檢測(cè)MyD88和NF-κB水平；光鏡和電鏡分別觀察其組織病理和超微結(jié)構(gòu)

9、改變；并提取肺組織中的線粒體，行膜電位(△ψm)、腫脹率及游離鈣水平測(cè)定。 結(jié)果：缺血再灌注損傷后，肺組織損傷性變化明顯。與成年兔組相比，嬰幼兒兔組肺組織有更多的白細(xì)胞侵潤(rùn)，肺泡細(xì)胞與間隔組織腫脹明顯，肺泡腔內(nèi)有較多的滲液，部分肺泡腔塌陷；出血多見(jiàn)；電鏡觀察下，可見(jiàn)部分肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞脫落，線粒體腫脹明顯，嵴破裂，甚至消失。線粒體膜電位下降明顯，游離鈣濃度明顯升高；MDA，ROS-HR濃度升高，但兩組存在顯著差異(P<0.

10、01)，SOD，GsH-PX活性下降，也同樣存在顯著差異；缺血再灌注過(guò)程中各時(shí)點(diǎn)的IL-1β、TNF-a水平也有不同程度升高，特別是再灌注后的2h、4h，(P<0.01)：再灌注后肺組織中MyD88和NF-κB表達(dá)也顯著升高。 結(jié)論：缺血再灌注可導(dǎo)致急性肺損傷；與成熟肺相比，嬰幼兒未成熟肺損傷更為嚴(yán)重。這可能與嬰幼兒相對(duì)低的抗氧化能力和產(chǎn)生更多的ROS有關(guān)。 第二部分依達(dá)拉唪預(yù)處理對(duì)嬰幼兒未成熟肺損傷保護(hù)作用研究

11、 目的：觀察依達(dá)拉唪(EdaraVone)預(yù)處理對(duì)缺血再灌注所致嬰幼兒未成熟肺損傷組織中MDA，ROS-HR，SOD及GsH-Px表達(dá)的影響，線粒體損傷改變，探討Edaravone清除氧自由基，減輕線粒體損傷，保護(hù)肺功能的作用。 方法：選用嬰幼兒(15-21天)新西蘭白兔各66只，隨機(jī)分配到對(duì)照組、缺血再灌注組和Edauravone預(yù)處理+缺血再灌注組。建立Sakuma單肺缺血再灌注模型，肺門(mén)阻斷1h后，開(kāi)放再灌注4h。Edar

12、aVone按1 mg/kg于缺血前5分鐘，通過(guò)耳緣靜脈注射處理；術(shù)畢收集肺組織分別進(jìn)行MDA，ROS-HR濃度及SOD，GSH-PX活性測(cè)定；Westemblot檢測(cè)MyD88和NF-κB水平；光鏡和電鏡分別觀察其組織病理-和超微結(jié)構(gòu)改變；并提取肺組織中的線粒體，行膜電位(△ψm)、腫脹率及游離鈣水平測(cè)定。 結(jié)果：依達(dá)拉唪預(yù)處理組肺組織中MDA，ROS-HR濃度明顯降低，相反SOD及GSII-PX活性明顯升高；同樣，依達(dá)拉唪預(yù)處

13、理后，明顯抑制缺血再灌注損傷所致的線粒體膜電位(△ψm)的下降，線粒體的腫脹亦明顯減輕；此與電鏡觀察下的肺超微結(jié)構(gòu)改變一致，肺泡上皮與血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落明顯減少，線粒體形態(tài)趨于正常，腫脹減輕，嵴破裂少；光鏡觀察，依達(dá)拉唪預(yù)處理組肺泡與肺泡間隔腫脹程度明顯輕于缺血再灌注組，肺泡腔滲液減少，出血少見(jiàn)。由此導(dǎo)致依達(dá)拉唪預(yù)處理組的生存率(83％)明顯高于缺血再灌注損傷組(50％)。 結(jié)論：依達(dá)拉唪(Edaravone)可通過(guò)清除氧自由基，