NF-κB在FVIIa-TF-PAR2促進SW620細胞增殖遷移中的作用探討.pdf

1、目的:探討NF-κB在FⅦa-TF／PAR2促進結(jié)腸癌細胞株SW620細胞增殖、遷移中的作用；進一步分析該過程中NF-κB的上游分子及其調(diào)控的效應(yīng)分子。
　　 方法:(1)采用Western blotting檢測PAR2激動劑(PAR2-AP)、凝血因子Ⅶa(FⅦa)、抗-PAR2抗體(α-PAR2)、抗-TF抗體(α-TF)等不同組合刺激SW620細胞后,細胞漿IκB-α、細胞核NF-κB(p65／RelA)的表達變化,從而分

2、析PAR2-AP及FⅦa對SW620細胞IκB-α／NF-κB通路的激活影響以及FⅦa的效應(yīng)是否依賴細胞表面的PAR2和TF。(2)采用NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)、PAR2-AP、FⅦa等刺激物或抑制物處理SW620細胞,分別用MTT法、Transwell法和流式細胞儀觀察PAR2-AP、FⅦa對細胞增殖遷移和細胞周期時相分布影響以及PDTC對這些過程的干預(yù)效應(yīng)

3、。(3)以Western blotting檢測PAR2-AP、FⅦa刺激對SW620細胞表達ERK1／2及其磷酸化的影響；進一步利用ERK1／2抑制劑(U0126)預(yù)處理細胞,觀察其對PAR2-AP、FⅦa誘導(dǎo)的IκB-α／NF-κB(p65／RelA)蛋白變化的干預(yù)效應(yīng),從而分析FⅦa-TF／PAR2引起IκB-α／NF-κB通路變化中,IκB-α／NF-κB的上游信號分子(4)SW620細胞經(jīng)PDTC、PAR2-AP、FⅦa等不同組

4、合處理后,以實時熒光定量PCR檢測細胞TF、白細胞介素-8(IL-8)、caspase-7mRNAs表達,Xa生成法檢測TF活性,進而分析NF-κB抑制劑對FⅦa-TF／PAR2調(diào)控TF、IL-8、caspase-7表達的干預(yù)作用。
　　 結(jié)果:(1)PAR2-AP(100μmol／L)、FⅦa(10 nmol／L)均能引起胞漿IκB-α蛋白表達降低、核NF-κB(p65／RelA)蛋白水平增高,且具有時間依賴性；α-PAR2及

5、α-TF均能明顯抑制FⅦa對細胞IκB-α／NF—κB(p65／RelA)蛋白表達的影響,而同型對照抗體mopc-21無此效應(yīng)。(2)PAR2-AP(100μmol／L)或FⅦa(10 nmol／L)均能促進細胞活力、遷移能力增強,使細胞S期比率升高,G0／G1期比率下降；PDTC能夠明顯削弱PAR2-AP、FⅦa對SW620細胞增殖、遷移及細胞周期分布的影響。(3)PAR2-AP(100μmol／L)、FⅦa(10 nmol／L)刺激

6、SW620細胞均可引起時間依賴的ERK1／2磷酸化水平增強；ERK1／2抑制劑U0126能夠明顯干預(yù)PAR2-AP、FⅦa對細胞IκB-α／NF-κB(p65／RelA)蛋白表達的影響。(4)PAR2-AP(100μmol／L)、FⅦa(10 nmol／L)分別作用SW620細胞,能引起細胞IL-8、caspase-7、TF mRNAs水平及TF活性改變,而PDTC能夠明顯干預(yù)此效應(yīng)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)在結(jié)腸癌

7、細胞株SW620細胞,FⅦa-TF／PAR2的活化能夠引發(fā)細胞內(nèi)IκB-α／NF-κB通路的激活。
　　 (2)NF-κB通路的激活對于FⅦa-TF／PAR2促進SW620細胞增殖與遷移過程是非常必要的。
　　 (3)在FⅦa-TF／PAR2→IκB-α／NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,ERK1／2是IκB-α／NF-κB的關(guān)鍵上游分子。
　　 (4)NF-κB激活后通過促進TF和IL-8、抑制凋亡蛋白caspase-