GHRH的體外表達(dá)和肌肉異位表達(dá)對(duì)大鼠的促生長(zhǎng)分析.pdf

1、生長(zhǎng)激素釋放激素(GrowthHormoneReleasingHormone，GHRH)是由下丘腦合成并分泌、存在于人和動(dòng)物體內(nèi)的一種生物活性物質(zhì)，能夠促進(jìn)垂體生長(zhǎng)激素(GrowthHormone，GH)的合成與分泌。腦外異位分泌的GHRH蛋白，不論是其成熟形式還是截短的多肽形式，都具有生物活性，并且血清中較低水平的GHRH就能很好的促進(jìn)GH的分泌。肌肉組織常常作為基因治療或基因免疫的靶器官，利用肌肉異位表達(dá)GHRH，可以提高動(dòng)物的生長(zhǎng)

2、速度和生產(chǎn)效益。 本研究借鑒基因治療和基因疫苗的原理構(gòu)建了兩種表達(dá)豬GHRH的表達(dá)質(zhì)?！猵HC和pCM。表達(dá)質(zhì)粒pHC含有由CMV極早期啟動(dòng)子和豬的骨骼肌alpha-肌動(dòng)蛋白(α-actm)啟動(dòng)子構(gòu)成的雜合啟動(dòng)子和雜合內(nèi)含子(intron)，表達(dá)質(zhì)粒pCM含有CMV啟動(dòng)子用來(lái)作為對(duì)照。在體外，將6種真核表達(dá)質(zhì)粒pGD、pGC、pGE、pGB、pHC和pCM轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞C2C12進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，另外用不含GHRHcDNA序列的

3、空質(zhì)粒p5f3f作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后C2C12細(xì)胞經(jīng)2％馬血清誘導(dǎo)分化為肌管細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h提取細(xì)胞總RNA和收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用RT-PCR和Northernblot檢測(cè)GHRH在mRNA水平上的表達(dá)，RIA和Westernblot檢測(cè)GHRH在蛋白水平上的表達(dá)，結(jié)果表明GHRH基因得到了成功表達(dá)并分泌到細(xì)胞外，并且，pCM載體的表達(dá)活性高于其他幾種載體的表達(dá)活性。體內(nèi)大鼠實(shí)驗(yàn)共分為7組(25只/組)

4、，包括6個(gè)質(zhì)粒處理組(0.2mg質(zhì)粒溶于0.2mlPBS中)和一個(gè)對(duì)照組(0.2mlPBS)，通過(guò)直接肌肉注射異位表達(dá)GHRH。結(jié)果表明，6種GHRH表達(dá)質(zhì)粒pHC、pGD、pGC、pGE、pCM和pGB對(duì)大鼠的生長(zhǎng)是有促進(jìn)作用的，增重提高率分別為6.42％、5.83％、5.32％、2.87％、1.11％和0.35％。從5天的階段性增重結(jié)果來(lái)看，在5-10天，pHC質(zhì)粒處理組大鼠的增重效果顯著，為40.73±0.88g而對(duì)照組為35.5

5、6±1.23g，p＜0.05：在10-15天，pHC質(zhì)粒處理組增重效果顯著，為37.49±2.85g而對(duì)照組為33.00±1.56g，p＜0.05；在15-20天，pGC組和pGB組效果顯著，分別為28.66±1.39g和26.78±1.40g，而對(duì)照組為21.77±1.27g，p＜0.05。同時(shí)，質(zhì)粒處理組大鼠血清IGF-I水平高于對(duì)照組。組織切片檢查和血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，通過(guò)肌肉注射GHRH表達(dá)質(zhì)粒沒(méi)有對(duì)大鼠造成不良影響。

6、 另外，將肌細(xì)胞特異表達(dá)基因的幾種調(diào)控元件序列：肌細(xì)胞-特異增強(qiáng)子結(jié)合核因子(MEF-1)、MEF-2、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子-1(TEF-1)和血清反應(yīng)元件位點(diǎn)(SRE)，經(jīng)過(guò)組合成合成啟動(dòng)子元件，構(gòu)建成表達(dá)載體pSP，以用來(lái)作為一種對(duì)照。通過(guò)在體外轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)，經(jīng)Northernblot和RIA檢測(cè)，結(jié)果表明，pSP質(zhì)粒在C2C12細(xì)胞中表達(dá)較高水平的GHRH，接近于CMV啟動(dòng)子質(zhì)粒pCM的表達(dá)水平。 通過(guò)本