綿羊CCL28和Granulysin基因的克隆與體外表達(dá).pdf

1、CC趨化因子配體28(CCL28)，又稱黏膜相關(guān)上皮趨化因子(MEC)，是新近發(fā)現(xiàn)的CC趨化因子家族成員，在人和小鼠的大部分黏膜組織(唾液腺、乳腺、小腸、大腸和氣管)中表達(dá)，并且是由以上組織的上皮細(xì)胞產(chǎn)生℃CL28對IgA抗體分泌細(xì)胞(IgA-ASCs)的歸巢起重要作用，此外，CCL28還具有廣譜的抗微生物活性。 Granulysin是一種表達(dá)于人體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK Cells)中的一種抗菌蛋白

2、，屬于SAPLIP(saposin-like protein)家族的一類脂封閉蛋白，是目前CTL胞漿顆粒中唯一證實(shí)具有抗菌活性的效應(yīng)分子。Granulysin能與穿孔素和顆粒酶共同定位于人的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞顆粒中，其作用相當(dāng)于廣譜抗菌素，作用范圍包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和寄生蟲，Granulysin也能殺滅人的腫瘤細(xì)胞。 為了研究CCL28和Granulysin在綿羊體內(nèi)是否具有同樣的功能，我們克隆

3、了綿羊CCL28和Granulysin基因，并得到了相應(yīng)的融合蛋白，試驗(yàn)分兩個(gè)系列。 一、綿羊CCL28基因的克隆與體外表達(dá)。利用同源序列克隆原理設(shè)計(jì)一對克隆引物，對綿羊結(jié)腸黏膜組織提取的總RNA行RT-PCR，將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化EcolJM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆、測序，并進(jìn)行序列分析；又根據(jù)克隆序列設(shè)計(jì)一對表達(dá)引物，用PCR法從重組克隆載體中擴(kuò)增出含BamHI/Xhol酶切位點(diǎn)的CCL28片段

4、，雙酶切后亞克隆至pGEX-4T-1載體，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pGEX-CCL28，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE鑒定?？寺〉木d羊CCL28基因包含完整的開放閱讀框架，長為444bp，ORF為387bp，編碼129個(gè)氨基酸，與人、小鼠、豬和牛該基因的同源性分別為76.4％、61.4％、84.3％和92.9％，推導(dǎo)的氨基酸序列與人、小鼠、豬和牛的同源性分別為76％、63％、84％和93％，信號肽

5、1～24aa，SCY功能域?yàn)?7～88aa，結(jié)構(gòu)特征與人、小鼠、豬和牛的CCL28相一致，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-CCL28，表達(dá)的融合蛋白分子量約為39ku，為進(jìn)一步研究綿羊CCL28的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 二、綿羊Granulysin基因的克隆與體外表達(dá)。基于電子延伸序列，設(shè)計(jì)一對克隆引物，對綿羊回腸黏膜組織提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR，將PCR產(chǎn)物與pMDl9-T載體連接后轉(zhuǎn)化Ec01.JMl09感受態(tài)細(xì)胞，

6、篩選陽性克隆、測序，并進(jìn)行序列分析；又根據(jù)克隆序列設(shè)計(jì)一對表達(dá)引物，用PCR法從重組克隆質(zhì)粒中擴(kuò)增出含BamHI/XhoI酶切位點(diǎn)的Oranulysin片段，雙酶切后亞克隆至pGEX-4T-1載體，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pGEX-Oranulysin，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE鑒定?？寺〉木d羊Granulysin基因包含完整的開放閱讀框架，長為509bp，ORF為438bp，編碼146個(gè)氨基