2009~2011年廣州地區(qū)兒童手足口病柯薩奇病毒A16型(CA16)流行病學(xué)調(diào)查及CA16-IgM抗體動(dòng)態(tài)規(guī)律分析.pdf

1、手足口病是由腸道病毒引起的急性傳染病，以腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CA16)感染為主。EV71病毒和CA16病毒它們的共同特點(diǎn)為:病毒顆粒大小為24-30nm，無(wú)外膜、單股正鏈RNA、四種顆粒蛋白(VP1-VP4)形成的五聚體、六聚體構(gòu)成病毒顆粒衣殼。而EV71病毒感染更加倍受關(guān)注，因?yàn)樗鶗?huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至死亡，其致死原因主要為嚴(yán)重的神經(jīng)病變，如腦干腦炎及無(wú)菌性腦膜炎。CA16病毒感染較EV71感染癥狀

2、輕，但能與EV71病毒合并感染并且交替流行，近年來(lái)也頗受觀注。
　　 這些年來(lái)，手足口病在亞太地區(qū)頻繁暴發(fā)，已逐漸成為一種潛在的危害全球公共健康的疾病?？焖儆行У脑\斷能夠預(yù)防疾病傳播，減少病人死亡。診斷腸道病毒感染的方法有病毒分離，核酸檢測(cè)，血清學(xué)檢測(cè)。本研究主要內(nèi)容是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR、病毒分離及中和實(shí)驗(yàn)診斷方法，對(duì)2009年～2011年珠江醫(yī)院手足口病人進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，從而分析CA16病毒三年來(lái)流行特點(diǎn);同時(shí)通過(guò)對(duì)CA16病

3、毒VP1基因測(cè)序后構(gòu)建基因進(jìn)化樹(shù)，分析2010年CA16病毒基因型，為CA16病原的流行趨勢(shì)，及進(jìn)化規(guī)律提供參考;根據(jù)2009～2011年手足口病人的臨床資料，分析不同腸道病毒導(dǎo)致心肌酶譜變化關(guān)系;此外，對(duì)收集的手足口病人血清進(jìn)行CA16-IgM及EV71-IgM抗體檢測(cè)，分析CA16-IgM抗體變化動(dòng)態(tài)規(guī)律及其與不同腸道病毒感染血清IgM抗體的交叉反應(yīng)。通過(guò)對(duì)這些病原學(xué)資料及血清學(xué)的研究，了解手足口病CA16病毒流行趨勢(shì)及基因進(jìn)化規(guī)律

4、，對(duì)疾病的流行及暴發(fā)起到預(yù)防監(jiān)控作用。
　　 因此，本研究分為以下兩大章節(jié):
　　 第一章2009～2011年廣州地區(qū)兒童手足口病柯薩奇病毒A16型(CA16)流行病學(xué)調(diào)查
　　 2009～2011三年間南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院住院及門(mén)診臨床診斷為手足口病患者共1239例，其中男813例，女426例，門(mén)診病人525例，住院病人714例，平均年齡35個(gè)月。收集這些病人的臨床資料、肛拭子及血清標(biāo)本。病人的臨床資料包括年齡

5、、性別、發(fā)病時(shí)間，發(fā)病癥狀，心肌損傷指標(biāo)，標(biāo)本采集時(shí)間。肛拭子標(biāo)本共采集1239份，另從住院患者中隨機(jī)獲取血清標(biāo)本497份。
　　 所有肛拭子標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，部分標(biāo)本進(jìn)行病毒分離后實(shí)時(shí)熒光PCR驗(yàn)證。2010年13株CA16病毒液及CA16臨床肛拭子標(biāo)本進(jìn)行VP1基因擴(kuò)增測(cè)序，隨后進(jìn)化樹(shù)分析。收集的497份急性期及恢復(fù)期血清，全部進(jìn)行心肌酶譜檢測(cè)。心肌酶譜檢測(cè)指標(biāo)包括:谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸肌酶(CK)、肌酸激酶

6、同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、羥丁酸脫氫酶(HBDH)。
　　 2009～2011年所有臨床診斷手足口病病人中年齡最大35歲，最小1個(gè)月。說(shuō)明成人兒童均可能感染手足口病。從三年的結(jié)果來(lái)看這些患兒年齡集中在5歲以內(nèi)，發(fā)病高峰在1～3歲，0～1歲兒童感染例數(shù)較少。這可能是因?yàn)?～1歲兒童母體抗體的存在，導(dǎo)致其不易感染，發(fā)病率較低，而5歲以內(nèi)兒童免疫系統(tǒng)還不完善，免疫力較低下，又無(wú)母體抗體的保護(hù)，成為手足口病的高發(fā)人群。

7、
　　 從性別來(lái)看2009～2011年所有臨床診斷手足口病患兒男女比例分別為:2.34:1、1.87:1及1.88:1。其中CA16病毒感染患者男女比例分別為:2.75:1、1.49:1及2.57:1。這些結(jié)果均顯示男性感染的機(jī)率高于女性，這可能是因?yàn)槟泻⒈扰⒑脛?dòng)，增加密切接觸腸道病毒感染物品及相互接觸傳染的機(jī)會(huì)。
　　 本院所采集的肛拭子標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果顯示:2009年所有臨床診斷手足口107例，檢出94例為腸

8、道病毒感染，13例為陰性，檢出率87.85％;2010年所有臨床診斷手足口553例，檢出505例為腸道病毒感染，48例為陰性，檢出率91.32％;2011年所有臨床診斷手足口579例，檢出515例為腸道病毒感染，檢出率88.95％。三年中CA16病毒感染引起的手足口病分別占所有腸道病毒感染手足口病的43.69％(45/94)、19.80％(122/505)及20.00％(107/515)。這些數(shù)據(jù)表明CA16病毒是手足口病感染的主要病原

9、之一，尤其2009年廣州地區(qū)流行的手足口病原以CA16為優(yōu)勢(shì)血清型，近兩年有所下降。
　　 從時(shí)間分布來(lái)看廣州地區(qū)2009年手足口病發(fā)病高峰在4～6月;2010年手足口病發(fā)病始于3月份，發(fā)病高峰在4～7月，峰值在5月份;2011年手足口病發(fā)病高峰在5～8月份，峰值在6月份，11月份也有一個(gè)發(fā)病小高峰，所以其曲線圖呈現(xiàn)“雙峰”形狀。2009、2010年CA16病毒的流行情況與當(dāng)年總的臨床診斷手足口病流行情況相似;2011年CA16

10、病毒發(fā)病始于5月份，高峰在7～12月，峰值在11月。從臨床癥狀來(lái)看，根據(jù)2010年版的《衛(wèi)生部手足口病診療指南》，2010年手足口病重癥49例，CA16病毒引起的重癥手足口病2例，占4.08％，2011年手足口病重癥48例，只有1例是由CA16病毒引起，占2.08％?？梢?jiàn)CA16病毒感染引起手足口病一般癥狀較輕，極少導(dǎo)致重癥。
　　 將部分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)為CA16病毒標(biāo)本進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)后再用實(shí)時(shí)熒光PCR重新分型驗(yàn)證。20

11、09年、2010年CA16病毒共分離58例，陽(yáng)性數(shù)為26，總的分離陽(yáng)性率為44.83％(26/58)。經(jīng)3代盲傳，病毒分離培養(yǎng)出現(xiàn)病變效應(yīng)的細(xì)胞上清實(shí)時(shí)熒光PCR初步鑒定，檢測(cè)結(jié)果與原始標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致。進(jìn)一步確認(rèn)原始標(biāo)本為CA16病毒。我們可以發(fā)現(xiàn)病毒分離方法，檢測(cè)敏感性較低。
　　 對(duì)所收集的497份臨床診斷手足口病人血清進(jìn)行心肌酶譜檢測(cè)。發(fā)病0～7天內(nèi)血清為急性期血清，大于7天收集的血清為恢復(fù)期血清，其中

12、7～14天內(nèi)為恢復(fù)期（早期）血清。再將這些血清按照患者感染的不同病毒種類(lèi)分為三種:EV71病毒感染組、CA16病毒感染組以及其它腸道病毒感染組。EV71病毒、CA16病毒以及其它腸道病毒感染者急性期心肌標(biāo)志物異常率分別為26.60％、44.19％及45.54％。
　　 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三種病毒心肌標(biāo)志物異常率有差別(x2=14.136，P=0.001)，且CA16病毒感染組急性期血清心肌標(biāo)志物異常率高于EV71病毒感染組。這一結(jié)果

13、表明，CA16病毒感染可能更易侵犯心肌細(xì)胞，引起心肌損傷。結(jié)合上面的臨床癥狀分析結(jié)果，相比之下，EV71病毒感染更易導(dǎo)致重癥，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。CA16病毒感染組急性期與恢復(fù)期（早期）比較，心肌指標(biāo)CK、CK-MB差異有顯著意義（CK: t=3.621，P=0.000; CK-MB: t=3.390，P=0.001）;相比這下，EV71病毒感染組兩個(gè)指標(biāo)均無(wú)差異(CK: t=1.715，P=0.088; CK-MB: t=-1.22

14、1，P=0.223)。從這一結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)CA16病毒感染一周后，心肌損傷有所恢復(fù)。盡管EV71病毒感染患者心肌標(biāo)志物異常率低于CA16病毒感染患者，但一旦發(fā)生心肌損傷，其恢復(fù)較慢。
　　 此外，我們還對(duì)2010年的CA16病毒株進(jìn)行基因進(jìn)化樹(shù)分析。19株CA16病毒成功擴(kuò)增并對(duì)13株病毒VP1基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)這13株均屬于B1型，其中4株為B1b，另9株為B1a，表明病毒存在一定變異和重組或具有不同祖先來(lái)源。這13株病毒株

15、的VP1區(qū)段與已登錄Genbank的廣東CA16序列比較:與2005年以前廣東深圳CA16序列比較，親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，與2009年深圳毒株比較，親緣關(guān)系較近，原因可能是廣東深圳兩地地理位置較近，但早期毒株可能由不同祖先進(jìn)化，而近期兩地毒株可能存在共同祖先;與臺(tái)灣地區(qū)CA16毒株比較結(jié)果，親緣關(guān)系也稍遠(yuǎn)，表明毒株可能進(jìn)化來(lái)源不同。
　　 第二章CA16-IgM抗體動(dòng)態(tài)規(guī)律分析
　　 2009年3月至2010年11月南方醫(yī)科大學(xué)

16、珠江醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室診斷為手足口病人中隨機(jī)抽取230人，其中男156人，女74人，年齡范圍為4～169個(gè)月，中位年齡26個(gè)月。收集這些病人從入院至出院的系列血清，共收集434份急性期和恢復(fù)期血清，血清采集時(shí)間從發(fā)病第一天至158天不等。另獲得75例呼吸道病毒感染病人系列血清105份。采用捕獲ELISA法檢測(cè)這些血清。實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)肛拭子標(biāo)本將病毒分類(lèi)分為: EV71病毒、CA16病毒及其它腸道病毒。其它腸道病毒以及呼吸道病毒感染患者血

17、清再通過(guò)中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其為非EV71、CA16病毒感染。
　　 我們對(duì)CA16病毒感染患者血清進(jìn)行捕獲酶聯(lián)法檢測(cè)進(jìn)而分析CA16-IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果為:發(fā)病第一天檢出率25％，發(fā)病第二天37％，發(fā)病第三天67％，發(fā)病第五天達(dá)86％，直到發(fā)病第八天，血清CA16-IgM抗體檢出率可達(dá)100％。CA16-IgM抗體可以在發(fā)病第一天檢出，并且可以持續(xù)數(shù)周。發(fā)病20周后，IgM抗體檢出率迅速下降。發(fā)病90天后，4份血清中只有一

18、份為弱陽(yáng)性(S/Co=1.09)。
　　 另一方面，通過(guò)對(duì)EV71病毒、其它腸道病毒、以及呼吸道病毒感染患者血清進(jìn)行CA16-IgM捕獲ELISA檢測(cè)，分析其交叉反應(yīng)。CA16-IgM捕獲ELISA檢測(cè)結(jié)果:211份EV71病毒感染患者血清中58份陽(yáng)性，其它腸道病毒感染患者48份血清中16份陽(yáng)性，呼吸道病毒感染患者血清105份中3份檢測(cè)陽(yáng)性。
　　 我們將全部66例CA16病毒感染病人119份血清分別進(jìn)行EV71-IgM

19、捕獲ELISA和CA16-IgM捕獲ELISA檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明30.3％(36/119)的CA16病毒感染病人血清，EV71-IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性，存在交叉。然而這36份交叉血清中有33份(91.7％) CA16-IgM抗體捕獲ELISA檢測(cè)OD450值高于EV71-IgM抗體捕獲ELISA檢測(cè)。盡管存在交叉反應(yīng)，但聯(lián)合兩種方法檢測(cè)，比較其OD450的比值，可以成功區(qū)分是CA16病毒感染還是與EV71病毒的交叉反應(yīng)導(dǎo)致的假陽(yáng)性。

20、　　 為了比較CA16-IgM酶聯(lián)法與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法的一致性，我們將同一天收集的肛拭子標(biāo)本和血清標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。結(jié)果:兩種方法檢測(cè)CA16病毒感染無(wú)差異(McNemar檢驗(yàn)P=0.148)，但是Kappa value=0.276(P=0.000)，相關(guān)系數(shù)偏低，表明兩種方法相關(guān)性不是很好。
　　 總的來(lái)說(shuō)CA16-IgM捕獲ELISA檢測(cè)CA16病毒感染是一種簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)的診斷方法。
　　 根據(jù)以上兩章節(jié)

21、的研究，小結(jié)如下:
　　 1.對(duì)2009～2011年手足口病流行病學(xué)調(diào)查，分析三年間CA16病毒的流行概況。2009、2010及2011年廣州地區(qū)手足口病以CA16病毒感染占所有腸道病毒感染手足口病患者的47.87％(45/94)、19.80％(122/505)及20.00％(107/515)。廣州地區(qū)由CA16病原導(dǎo)致的手足口病有所下降。
　　 2.2009、2010年CA16病毒的流行情況與當(dāng)年總手足口病流行情況相似

22、，發(fā)病高峰在4～7月;2011年CA16病毒感染導(dǎo)致手足口病始于5月，高峰在7～12月。三年間所有手足口患兒及CA16感染導(dǎo)致的手足口病均為男性患兒高于女性患兒?；純喊l(fā)病年齡集中在5歲以內(nèi)，5歲以內(nèi)所有手足口病患兒及CA16病毒感染患兒的比例分別為:92.11％、96.35％。
　　 3.CA16病毒感染患兒急性期心肌酶標(biāo)志物異常率高于EV71感染患兒。CA16病毒感染患兒急性期（0～7天）與恢復(fù)早期（8～14天）CK、CK-M

23、B均有差異。EV71病毒感染患兒急性期與恢復(fù)早期CK、CK-MB統(tǒng)計(jì)無(wú)差異。這一結(jié)果表明CA16病毒比EV71病毒可能更易親嗜心肌細(xì)胞，但心肌酶標(biāo)志物恢復(fù)正常較EV71病毒感染快。
　　 4.對(duì)13株2010年CA16病毒VP1基因擴(kuò)增后測(cè)序，進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果為B1型。說(shuō)明2010年廣州地區(qū)流行的CA16病毒可能為B1型。
　　 5.CA16-IgM抗體動(dòng)態(tài)規(guī)律研究表明:CA16-IgM抗體不僅可以在發(fā)病第一天產(chǎn)生，并且可

24、以持續(xù)數(shù)周，直到發(fā)病第八天，血清CA16-IgM抗體檢出率可達(dá)100％。發(fā)病20周后，IgM抗體檢出率迅速下降。發(fā)病90天后，4份血清中只有一份檢出很微弱的陽(yáng)性(S/Co=1.09).
　　 6.由于腸道病毒間存在一些同源性，有共同的氨基酸序列，故CA16-IgM檢測(cè)存在一定交叉反應(yīng)。分別對(duì)EV71病毒、其它腸道病毒、以及呼吸道病毒感染患者血清進(jìn)行CA16-IgM捕獲ELISA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率分別為:27.48％(58/21

25、1)、33.33％(16/48)及2.86％(3/105)。盡管存在交叉反應(yīng)，但聯(lián)合EV71-IgM及CA16-IgM捕獲ELISA兩種方法檢測(cè)，比較其OD450的比值，可以成功區(qū)分是CA16病毒感染還是與EV71的交叉反應(yīng)導(dǎo)致的假陽(yáng)性。
　　 7.對(duì)來(lái)自同一天收集的肛拭子標(biāo)本及血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，比較實(shí)時(shí)熒光PCR與CA16-IgM捕獲ELISA方法一致性，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明兩種方法沒(méi)有差異，但相關(guān)系數(shù)不高?？傊?，CA16-IgM酶聯(lián)