繁茂膜海綿原細(xì)胞的鑒別、分離純化和體外培養(yǎng)研究.pdf

1、海綿是一種重要的海洋藥用無脊椎動物.海綿細(xì)胞體外培養(yǎng)是解決海綿藥物供給不足問題最具希望和富有挑戰(zhàn)性的課題.本研究旨在發(fā)展一種海綿干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法,探索利用海綿干細(xì)胞體外培養(yǎng)建立海綿細(xì)胞系的可能性.論文以大連海域繁茂膜海綿的干細(xì)胞-原細(xì)胞為對象,研究了原細(xì)胞的鑒別、分離純化及體外培養(yǎng)(增殖和分化)等問題. 首先,考察了繁茂膜海綿主要類型細(xì)胞在光、電鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征.形成了在光鏡下鑒別、計(jì)數(shù)原細(xì)胞的方法和標(biāo)準(zhǔn).并應(yīng)用BrdU攝取

2、法和PCNA檢測法,進(jìn)一步證明了原細(xì)胞作為海綿干細(xì)胞所具有的增殖分裂潛力. 第二,建立了一種分離、純化原細(xì)胞的新方法.利用原細(xì)胞與其它類型細(xì)胞的差異,形成了差速離心、選擇性聚集、差速粘附和密度梯度離心四步集成分離方法.有效地實(shí)現(xiàn)了原細(xì)胞的富集,富集濃度達(dá)到了80﹪以上. 第三,比較了原細(xì)胞含量不同細(xì)胞體系的體外培養(yǎng)增殖特征.初步發(fā)現(xiàn),原細(xì)胞具有活躍的增殖能力；高富集度原細(xì)胞體外原代培養(yǎng)過程中所顯示的增殖和生物量增加能力,

3、顯著優(yōu)于混合細(xì)胞和低濃度原細(xì)胞培養(yǎng),首次實(shí)現(xiàn)了總細(xì)胞的倍增,顯示了以原細(xì)胞為基礎(chǔ)建立傳代細(xì)胞系的可能性.高富集原細(xì)胞連續(xù)兩次傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),由于原細(xì)胞的分化等原因,其增殖速率明顯下降. 論文還研究了上皮和膠原細(xì)胞對原細(xì)胞分化的影響.初步發(fā)現(xiàn),當(dāng)該兩種細(xì)胞與原細(xì)胞比例大于2:1混合培養(yǎng)時(shí),所形成的細(xì)胞聚集體將分化成功能性小海綿.而高富集度原細(xì)胞培養(yǎng),雖能發(fā)生一定分化,但不能發(fā)育成小海綿. 最后,本研究分離提取了造骨細(xì)胞特異性