新型小分子Rab7b在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)K562細胞死亡及在自噬中的作用研究.pdf

1、高三尖杉酯堿是我國自主研制成功的高效抗白血病藥物,其可能通過誘導(dǎo)白血病細胞分化和凋亡等機制發(fā)揮細胞毒作用,具體機制有待進一步研究。Rab作為Ras蛋白超家族的一類小G蛋白,參與細胞的內(nèi)吞外排等蛋白轉(zhuǎn)運過程,近年來發(fā)現(xiàn)某些Rab蛋白如Rab7與細胞的自噬以及凋亡過程密切相關(guān)。Rab7b是我們課題組自主發(fā)現(xiàn)的一個新的小G蛋白,與Rab7高度同源,特異性的表達在髓系細胞,并與人白血病細胞分化相關(guān),前期研究發(fā)現(xiàn)其定位于溶酶體。
　　 本

2、研究中我們檢測了高三尖杉酯堿處理后K562細胞的自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的表達和凋亡的變化及可能機制,以及抑制自噬后凋亡變化。并將Rab7b及其突變體轉(zhuǎn)染到K562細胞,從正反兩方面探討Rab7b在HHT誘導(dǎo)K562細胞凋亡中的作用,并檢測饑餓誘導(dǎo)自噬時Rab7b及其突變體在K562細胞中的亞細胞定位及在自噬通路中的可能作用。
　　 首先我們用MTT法檢測HHT誘導(dǎo)K562細胞后細胞活力,用Annexin V／PI雙染法檢測K562細胞

3、凋亡,并用Western blot檢測自噬體的標(biāo)志物L(fēng)C3的表達,用自噬抑制劑3-Methyladenine(3-MA)抑制K562細胞自噬后檢測HHT誘導(dǎo)的K562細胞凋亡變化,并用Western blot檢測caspase3,9的蛋白表達及ERK1／2,Akt,Beclin1的變化,同時,我們構(gòu)建了Rab7b、Rab7b的持續(xù)活化型突變(Rab7b-Q67L)、Rab7b的失活型突變(Rab7b-ΔCC)和Rab7b干擾(Rab7b

4、-RNAi)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染到K562細胞,用Annexin V／PI雙染法檢測表達不同的Rab7b突變型的K562細胞的凋亡變化,并用Western blot檢測caspase3,9的蛋白表達及ERK1／2,Akt表達的不同,用EBSS液誘導(dǎo)K562細胞自噬,Western blot檢測自噬體的標(biāo)志物L(fēng)C3及Rab7b的表達,把帶綠熒光GFP的Rab7b-GFP、Rab7b的持續(xù)活化型突變(Rab7b-Q67L-GFP)、Rab7b的失活型

5、突變(Rab7b-ΔCC-GFP)瞬時轉(zhuǎn)染到K562細胞中,并用LC3B的熒光一抗或MDC標(biāo)記自噬泡,EBSS饑餓誘導(dǎo)自噬后,用激光共聚焦顯微鏡觀察Rab7b在K562細胞中的亞細胞定位及其與LC3或MDC的共定位情況,并用各種自噬通路的抑制劑后觀察其對Rab7b亞細胞定位的影響。
　　 研究發(fā)現(xiàn)HHT誘導(dǎo)K562細胞后自噬減少凋亡增加,這種凋亡增加是caspase依賴性的,在下調(diào)Akt的同時ERK通路上調(diào),Beclin1表達上

6、調(diào),自噬減少進一步促進凋亡增加。過表達Rab7b的K562細胞可進一步增強HHT誘導(dǎo)K562細胞凋亡作用。這一作用與Akt通路下調(diào)及ERK通路上調(diào)有關(guān)。饑餓誘導(dǎo)自噬時Rab7b表達增高,Rab7b定位于自噬體,它與MDC或LC3標(biāo)記的自噬體有共定位,這種定位功能依賴于其定位序列。Rab7b參與饑餓誘導(dǎo)的自噬體形成過程,并參與內(nèi)體與自噬體融合過程。本研究首次提出自噬在HHT5臺療白血病中的作用機制,為自噬與腫瘤、自噬與凋亡的關(guān)系研究提出新