哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)促進(jìn)腎臟衰老的機(jī)制研究.pdf

1、腎臟功能隨著年齡增長逐漸下降，老年人慢性腎臟疾病的發(fā)生率高，且治療有效率低，死亡率高，所以研究腎臟衰老的機(jī)制和尋找延緩腎臟衰老的策略對老年腎臟損害的防治有重要意義。腎臟衰老的特征是隨年齡增長出現(xiàn)腎小球肥大、系膜增生、腎小球硬化和腎小管-間質(zhì)纖維化等病理變化。但出現(xiàn)這一現(xiàn)象的分子機(jī)制并不完全清楚。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）特異性的抑制劑雷帕霉素可抑制腎小

2、球肥大及腎小管-間質(zhì)的炎癥和纖維化。另外，越來越的證據(jù)表明mTOR與細(xì)胞及機(jī)體衰老有著千絲萬縷的聯(lián)系，因此我們推斷，mTOR參與了腎臟病變發(fā)生發(fā)展的過程，其表達(dá)異?？赡茉谀I臟衰老過程中發(fā)揮著某種作用。為此本研究首先觀察mTOR在不同月齡大鼠腎臟組織的表達(dá)情況；并培養(yǎng)不同月齡的原代大鼠系膜細(xì)胞及WI-38細(xì)胞，觀察mTOR在細(xì)胞中隨齡表達(dá)變化；再以細(xì)胞周期為切入點(diǎn)，進(jìn)一步研究mTOR在細(xì)胞衰老進(jìn)程中的作用機(jī)制。 目的：研究mTOR

3、在大鼠系膜細(xì)胞/腎組織中隨增齡的表達(dá)變化及在細(xì)胞衰老過程中的作用機(jī)制。 方法：取3月齡、12月齡和24月齡大鼠的腎臟組織，用RT-PCR及Western blot的方法，觀測mTOR mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化；用免疫組化法觀察mTOR在腎組織中的定位和表達(dá)。并分離培養(yǎng)各時間點(diǎn)大鼠腎臟系膜細(xì)胞及WI38細(xì)胞，觀測mTOR mRNA和蛋白質(zhì)及其他衰老相關(guān)指標(biāo)在細(xì)胞隨齡的變化情況，用免疫熒光法檢測mTOR的定位和表達(dá)變化。應(yīng)用mTO

4、R的激動劑和抑制劑分別干預(yù)WI38細(xì)胞，檢測衰老的相關(guān)指標(biāo)，包括用β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）染色方法檢測了衰老相關(guān)SA-β-gal染色陽性率，用流式細(xì)胞儀檢測了細(xì)胞周期的變化及細(xì)胞大小，并計數(shù)了細(xì)胞分裂的代數(shù)等。并利用激光共聚焦技術(shù)觀察mTOR與細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)控蛋白p21WAF1/CIP1/SDI1之間的關(guān)系，從而進(jìn)一步明確mTOR在細(xì)胞衰老過程中的作用機(jī)制。 結(jié)果：①、mTOR在腎小球系膜基質(zhì)及腎小管-間質(zhì)表達(dá)，其

5、mRNA和蛋白表達(dá)水平及磷酸化的活性蛋白隨增齡逐漸上升，且其與增齡引起的腎臟病變有顯著相關(guān)性。②、mTOR在細(xì)胞胞漿及胞核皆有表達(dá)，在不同細(xì)胞（大鼠原代系膜細(xì)胞及人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞）衰老過程中，其表達(dá)隨月齡/代齡的增加而逐漸增強(qiáng)。③、mTOR的激動劑能上調(diào)P21WAF1/CIP1/SDI1及Cyclin D1基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)，引起細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞肥大，縮短細(xì)胞的傳代次數(shù)；mTOR的抑制劑能下調(diào)P21WAF1/CIP1/SDI