哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路在吸煙誘導(dǎo)的氣道炎癥和慢性阻塞性肺疾病中的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種可以預(yù)防和治療的慢性氣道炎癥性疾病，疾病發(fā)展過(guò)程伴有不完全可逆的氣流受限，其病理學(xué)基礎(chǔ)是氣道對(duì)不同有害顆粒和氣體刺激引發(fā)的異常炎癥反應(yīng)。COPD的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，可能跟氣道炎癥，氧化應(yīng)激，蛋白酶/抗蛋白酶失衡，微生物病原體，自身免疫，細(xì)胞凋亡等有關(guān)。吸煙是COPD最主要的誘發(fā)因素之一，臨床研究結(jié)果顯示吸煙產(chǎn)生的活性氧分子

2、(reactive oxygen species，ROS)作用于肺泡巨噬細(xì)胞和表皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致炎癥因子的大量表達(dá)和生長(zhǎng)因子的釋放。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ROS還能誘導(dǎo)和促進(jìn)表皮細(xì)胞的凋亡。
　　mTOR（Mechanistic Target of Rapamycin，mTOR）是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇3激酶(PI3K)相關(guān)的激酶家族。機(jī)體和細(xì)胞利用mTOR信號(hào)通路感受并整合各種外界因素如生長(zhǎng)因子、應(yīng)激水平、能量水

3、平、氧氣濃度以及氨基酸水平等的影響，通過(guò)調(diào)控其下游各種信號(hào)途徑調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始、脂質(zhì)體合成、能量代謝以及細(xì)胞自噬等生理過(guò)程，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，并保持機(jī)體和細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)平衡。其中最重要的一項(xiàng)功能是調(diào)控細(xì)胞自噬。自噬是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無(wú)核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代

4、謝需要和某些細(xì)胞器的更新。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬可能通過(guò)介導(dǎo)吸煙誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致COPD的形成;細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3B的缺失抑制了吸煙誘導(dǎo)的COPD;而Egr-1和Cav-1等分子則可能通過(guò)其對(duì)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的調(diào)控而影響吸煙誘導(dǎo)的COPD的形成。據(jù)此，我們提出本論文的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題:細(xì)胞自噬的上游信號(hào)mTOR是否也在吸煙誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞損傷和COPD形成過(guò)程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用？如果可以，mTOR又是通過(guò)什么樣的分子機(jī)制調(diào)控

5、這一過(guò)程？
　　針對(duì)上述假設(shè)，體外研究擬利用香煙煙霧提取物(Cigarette Smoke Extract，CSE)處理人體氣道上皮細(xì)胞系以及檢測(cè)慢性阻塞性肺疾病患者和正常非吸煙者的肺組織標(biāo)本。體內(nèi)研究擬構(gòu)建氣道上皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞mTOR特異性誘導(dǎo)敲除小鼠并給予香煙煙霧暴露，通過(guò)測(cè)定mTOR相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)、細(xì)胞自噬與凋亡、炎癥因子表達(dá)、氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、粘液分泌以及小鼠肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)等因素，闡明mTOR信

6、號(hào)通路在吸煙誘導(dǎo)的氣道炎癥和COPD分子發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵調(diào)控作用，為有效預(yù)防和治療吸煙誘導(dǎo)的氣道炎癥提供新思路，為開(kāi)發(fā)新型COPD防治藥物提供新靶點(diǎn)。
　　第一部分:AMPK/TSC2/mTOR信號(hào)通路在CSE誘導(dǎo)的人體氣道上皮細(xì)胞系炎癥和凋亡以及COPD患者肺組織中的調(diào)控作用及其機(jī)制研究
　　目的:證實(shí)CSE能誘導(dǎo)人體氣道上皮細(xì)胞系mTOR信號(hào)通路相關(guān)分子的磷酸化水平或者表達(dá)水平的改變;并通過(guò)應(yīng)用饑餓或siRNA干擾技術(shù)，

7、證明mTOR能調(diào)控CSE誘導(dǎo)的人體氣道上皮細(xì)胞炎癥因子釋放、自噬、壞死與凋亡。
　　方法:以3％低濃度CSE干預(yù)人體氣道上皮細(xì)胞系HBE，做不同的濃度和時(shí)間點(diǎn)處理，0、1、4、8、和24h后收集細(xì)胞。Western Blot和Q-PCR法檢測(cè)mTOR相關(guān)信號(hào)分子（AMPKa、TSC1、TSC2、mTOR、S6和LC3B）的磷酸化水平或者表達(dá)水平。Elisa和Q-PCR法檢測(cè)炎癥因子IL-6、IL-8的mRNA和蛋白質(zhì)水平。然后，以

8、較高濃度10％的CSE，干預(yù)人體氣道上皮細(xì)胞系HBE，做不同的濃度和時(shí)間點(diǎn)處理，0、1、4、8和12h后收集細(xì)胞。Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白CleavedCaspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。最后，利用HBSS溶液饑餓誘導(dǎo)、TSC2 siRNA和mTOR siRNA基因沉默以及給予藥物抑制劑等方法，研究AMPKα/TSC2/mTOR信號(hào)通路在CSE誘導(dǎo)人體氣道上皮細(xì)胞中炎

9、癥因子分泌、自噬與凋亡的水平。另外，Western Blot和免疫組化方法檢測(cè)慢性阻塞性肺疾病患者和正常非吸煙者肺組織mTOR和壞死蛋白R(shí)IP3的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，CSE組在人體氣道上皮細(xì)胞系HBE中誘導(dǎo)AMPK的磷酸化和TSC1/2的高表達(dá)，下調(diào)mTOR和p-S6的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)增加。同時(shí)，炎癥因子IL-6和IL-8表達(dá)水平以及粘蛋白Muc5ac表達(dá)也明顯增加。凋亡蛋白cleav

10、ed caspase-3和cleaved-caspase-9表達(dá)增加。沉默TSC2基因或應(yīng)用自噬抑制劑氯喹和巴佛洛霉素A1下調(diào)CSE誘導(dǎo)的炎癥和凋亡。相反，應(yīng)用HBSS溶液饑餓誘導(dǎo)或沉默mTOR基因CSE誘導(dǎo)的炎癥和凋亡增加。通過(guò)對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者和正常非吸煙者肺組織檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)mTOR和p-S6蛋白表達(dá)水平有一定程度下降，相反，壞死蛋白R(shí)IP3表達(dá)水平增加。
　　結(jié)論:AMPKα-TSC2-mTOR信號(hào)通路調(diào)控CSE誘導(dǎo)人體氣

11、道上皮細(xì)胞中炎癥因子分泌，自噬、壞死與凋亡。沉默TSC2基因或應(yīng)用自噬抑制劑氯喹和可以保護(hù)CSE誘導(dǎo)的炎癥和凋亡。相反，饑餓或沉默mTOR基因惡化CSE誘導(dǎo)的炎癥和凋亡。
　　第二部分:mTOR信號(hào)通路在香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的小鼠慢性氣道炎癥和肺氣腫模型中的研究
　　目的:利用C57BL/6、氣道上皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞mTOR特異性誘導(dǎo)敲除的小鼠，從體內(nèi)證實(shí)mTOR信號(hào)通路在吸煙誘導(dǎo)的氣道炎癥和肺氣腫形成中的關(guān)鍵調(diào)控作用。<

12、br>　　方法:野生型的C57BL/6小鼠給予香煙煙霧分別暴露0、12周、24周，Western Blot、Q-PCR和免疫組化檢測(cè)mTOR相關(guān)信號(hào)分子的磷酸化水平或者表達(dá)水平、炎癥表達(dá)水平和肺氣腫情況。利用mTORflox/flox小鼠，分別和氣道上皮細(xì)胞(CC10-rtTA/(tetO)7-Cre-）、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(SP-C-rtTA/(tetO)7-Cre-）的工具小鼠合籠，構(gòu)建氣道上皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞mTOR特異性誘導(dǎo)

13、敲除的小鼠品系，并給與口服強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)mTOR基因敲除。上述兩種mTOR誘導(dǎo)敲除的小鼠以及其同窩對(duì)照組小鼠隨機(jī)分成吸煙組和空氣對(duì)照組，香煙煙霧暴露(0、4周、8周、12周、24周)，構(gòu)建慢性氣道炎癥和肺氣腫模型。Q-PCR和ELISA法檢測(cè)氣道炎癥因子IL-6和IL-8的分泌。Western blot和免疫組化方法檢測(cè)凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9、壞死蛋白R(shí)IP3以及mTOR相關(guān)信號(hào)分子

14、（TSC2、mTOR、S6和LC3B）的磷酸化水平或者表達(dá)水平。
　　結(jié)果:香煙煙霧暴露24周后，野生型小鼠肺組織mTOR和p-S6水平顯著下降，而TSC2蛋白表達(dá)水平增高。另外，與香煙煙霧暴露10周后的mTOR未誘導(dǎo)敲除小鼠相比，Western Blot和免疫組化結(jié)果顯示氣道上皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞mTOR特異性誘導(dǎo)敲除小鼠肺組織中，mTOR蛋白水平下降明顯。H&E染色結(jié)果顯示肺組織一定程度上出現(xiàn)異常，小鼠肺平均內(nèi)襯間隔(ML