白藜蘆醇及花生根粗提物對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用研究——阿爾茨海默病的一級預(yù)防初探.pdf

1、研究背景和目的:
　　 阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)又稱老年性癡呆，是最為常見的老年腦部神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于65歲及以上老年人群，大約占所有癡呆病例的50.75％。其主要病理改變包括腦神經(jīng)元死亡、Tau蛋白異常聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles，NFTS)、神經(jīng)細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(amyloid-βpeptide，Aβ)聚集形成老年斑(senileplaques，

2、SP)等。這種疾病表現(xiàn)為全面的認(rèn)知障礙，包括:記憶、定位、判斷和推理等方面的障礙。該病最終導(dǎo)致患者生活能力喪失，嚴(yán)重?fù)p害老年人的身心健康，同時也是影響家庭和社會發(fā)展的重要制約因素之一。
　　 2010年國際阿爾茨海默病協(xié)會(Alzheimer'sAssociation,AA)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，在嚴(yán)重危害人類健康的四大疾病——心臟病、糖尿病、腦梗死和前列腺癌的死亡率紛紛下降之時，AD的死亡率卻持續(xù)上升。在美國的65歲及以上老年人群中

3、，AD病的死亡率高居第四位。僅美國就有近530萬AD患者，平均每70s就新增1例AD患者。截止到2010年，與AD有關(guān)的費用支出已經(jīng)高達(dá)1720億美元。2010年全球癡呆患者約3560萬人，并以每20年翻一番的速度遞增，估計到2030年，全球癡呆患者將達(dá)到6570萬人。到2050年，全球癡呆患者將達(dá)到1億1千萬人以上。其中60％出現(xiàn)在發(fā)展中國家，且呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。根據(jù)2005年我國首次流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果估計，65歲以上老年人的癡呆患病

4、率為7.8％，其中AD患病率為4.8％，是血管性癡呆(1.1％)的4.36倍，且隨著年齡增長而增加。
　　 中國是世界上人口老化基數(shù)最大的國家，隨著中國人口老年化時代的到來，2006年，65歲及以上老年人口已達(dá)1.34億。據(jù)此估計，我國的癡呆人數(shù)已近800萬，其中AD近600萬，到21世紀(jì)中葉，老年人口將增加到4億，AD患者將接近2000萬人。因此，中國雖然不是老年癡呆發(fā)病率最高的國家，但卻是世界上癡呆人數(shù)最多且增長速度最快的國

5、家。如何針對阿爾茨海默病采取有效的預(yù)防和治療措施已逐漸成為我國當(dāng)前醫(yī)療保健服務(wù)體系和經(jīng)濟社會發(fā)展中急需解決的重大問題。
　　 盡管目前AD的發(fā)病機制還不完全清楚，但隨著人們對AD研究的深入，星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AS)在AD的病理改變中起到的作用引起越來越多的關(guān)注。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Aβ沉積激活A(yù)S引起的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激是AD的重要病理機制。膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量眾多的一大類細(xì)胞，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總數(shù)的90％，其

6、中，AS是膠質(zhì)細(xì)胞的重要組成部分，幾乎包括了膠質(zhì)細(xì)胞的所有功能。既往認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)信息傳遞與整合是由神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)完成的，星形膠質(zhì)細(xì)胞僅是被動的輔助角色，起到支持、提供營養(yǎng)以及協(xié)助代謝等作用。近年隨著膜片鉗及分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)AS在維持神經(jīng)元內(nèi)外環(huán)境、生存、遷移、免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、軸突生長及功能整合等方面都具有重要作用，對神經(jīng)元生存起到重要作用，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病密切相關(guān)。阿爾茨海默病的關(guān)鍵性特征之一是腦內(nèi)炎癥

7、，炎癥過程是由星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子所介導(dǎo)，并參與免疫反應(yīng)。炎癥是Aβ沉積引起的繼發(fā)性反應(yīng)，也是導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變的重要因素。Aβ蛋白的病理性沉積能夠激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，并高度表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞特征性蛋白——膠原纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidprotein,GFAP)。過度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)（例如IL-1β、TNF—-α、IL-8、MCP-1等），繼而將誘導(dǎo)型一氧化氮酶(in

8、duciblenitricoxidesynthase，iNOS)激活，產(chǎn)生一氧化氮(nitricoxide，NO)及活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)，后者又可以與活性氮簇(reactivenitrogenspecies，RNS)作用，生成過氧化硝酸鹽。這種過氧化物能對細(xì)胞產(chǎn)生很強的毒性，引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用還會進(jìn)一步增加炎癥因子前體、補體以及氧化物的產(chǎn)生。這些炎癥介質(zhì)和氧化

9、物的產(chǎn)生會導(dǎo)致Aβ的進(jìn)一步聚積，從而將細(xì)胞內(nèi)炎癥因子介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步擴大，使之進(jìn)入惡性循環(huán)。
　　 因此，抑制由過度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥反應(yīng)有可能對抑制AD病的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。
　　 但是關(guān)于AD的病因及發(fā)病機制至今尚未完全明確，因此目前尚無特效治療藥物。要更有效地降低AD的發(fā)病率，必須抓好疾病防治的一級預(yù)防措施:如在食品中添加有效預(yù)防AD的食品添加劑也可能是一種低成本、有意義的預(yù)防AD的好辦法。白

10、藜蘆醇(trans-resveratrol，Res)，可能是一種較理想的食品添加劑，美、日等國家已經(jīng)使用。其作為一種抗氧化、抗誘變和抗感染活性成分，有明顯的抗炎、抗衰老、抗癌癥和抗心腦血管疾病的作用。其化學(xué)名3，5，4'-三羥基反式芪(3，5，4’-trihydroxystilbene)，一般為反式白藜蘆醇，它常與順式異構(gòu)體(cis-resveratrol)及白藜蘆醇甙(resveratrolglucoside)共同存在于葡萄、桑葚、花

11、生等植物和食品中，尤其在紅葡萄酒中的含量較高。由于白藜蘆醇及其衍生物具有抗菌、抗氧化、抗血栓、腫瘤等諸多的生理活性，在食品、醫(yī)藥、植物生理等領(lǐng)域受到國內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注。目前研究表明，白藜蘆醇能有效的對抗中樞神經(jīng)缺血損傷，保護(hù)缺血區(qū)神經(jīng)元，減少梗死范圍，降低缺血再灌注所造成的遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，改善腦缺血引起的肢體運動功能障礙。白藜蘆醇對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用已有較多研究，但目前的研究主要集中在神經(jīng)元上，對于星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響少見報道。本

12、研究通過檢測不同濃度白藜蘆醇對于炎癥損傷狀態(tài)下星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥遞質(zhì)釋放的影響，探索白藜蘆醇對神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。為AD的預(yù)防探索新的可能途徑。本研究運用一種新型、穩(wěn)定的星型膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，并成功復(fù)制了由炎癥引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。通過對比損傷前后星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥遞質(zhì)的釋放以及炎癥損傷對于NO/iNOS信號系統(tǒng)表達(dá)的影響，并檢測乳酸脫氫酶（lactatedehydrogrnase，LDH）的漏出量，了解白藜蘆醇對于損傷狀態(tài)下對星形膠

13、質(zhì)細(xì)胞的影響。為白藜蘆醇對抗中樞神經(jīng)損傷以及減緩AD癥狀發(fā)展的一級預(yù)防措施提供新的實驗依據(jù)。
　　 白藜蘆醇的抗衰老活性和神經(jīng)保護(hù)作用為開發(fā)和研制更多的白藜蘆醇抗AD藥品以及保健品提供新的思路。目前市場銷售的白藜蘆醇多是從天然植物中提取的，但植物提取技術(shù)面臨成本高，得率低和植物資源有限等問題。所以人們嘗試開發(fā)新的白藜蘆醇合成途徑。目前研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的合成途徑包括:化學(xué)合成和生物合成?；瘜W(xué)合成的優(yōu)點在于選擇性高，但由于成本高、使

14、用的催化劑價格昂貴且毒性大，所以不適合用于工業(yè)化生產(chǎn)，目前僅處于實驗室研究階段。近幾年人們的目光已經(jīng)從化學(xué)合成轉(zhuǎn)向生物合成。
　　 本實驗室以往研究初步嘗試并成功建立了一種白藜蘆醇植物生物合成的方法，即在實驗室無菌環(huán)境下培育高產(chǎn)根系的花生，并對花生根系進(jìn)行誘導(dǎo)，使之能夠大量、穩(wěn)定的生產(chǎn)含白藜蘆醇的混合提取物，建立了從花生發(fā)芽到產(chǎn)生白藜蘆醇的一整套實驗室生物合成方案。然而，花生根誘導(dǎo)提取物對細(xì)胞活性的影響如何、是否具有抗炎保護(hù)效應(yīng)

15、、與白藜蘆醇純品相比，其效應(yīng)大小如何;這些都是本文要研究的重點問題。
　　 因此，本研究通過在實驗室以往研究建立的合成方案基礎(chǔ)之上，優(yōu)化混合物的提取工藝。進(jìn)一步對比研究花生根誘導(dǎo)提取物與白藜蘆醇純品分別對脂多糖損傷下星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎保護(hù)作用。
　　 研究思路:
　　 一、優(yōu)化改進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法及AD炎癥細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ偷慕?br>　　 運用微孔濾膜過濾的方法，純化乳鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞，替代傳統(tǒng)的差

16、速貼壁方法純化星型膠質(zhì)細(xì)胞的方法，降低了實驗操作難度。之后通過GFAP免疫組化法鑒定乳鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度，采用不同濃度脂多糖LPS（lipopolysaccharide）對細(xì)胞進(jìn)行不同時長的損傷，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。
　　 二、白藜蘆醇對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 給予不同濃度白藜蘆醇（5、25、50μmol/L）預(yù)處理后，進(jìn)行LPS損傷24h，Griess法檢測NO釋放量，Elisa法檢測TNF-α

17、表達(dá)量及Westernblot法檢測iNOS蛋白的表達(dá)水平。通過檢測NO、TNF-α了解白藜蘆醇對損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的情況;通過檢測iNOS蛋白的表達(dá)水平以及LDH的漏出量，了解白藜蘆醇對LPS引起星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用以及這種保護(hù)作用是否與iNOS/NO的表達(dá)通路有關(guān)。
　　 三、無土栽培高產(chǎn)花生根系誘導(dǎo)白藜蘆醇
　　 采用本實驗室已經(jīng)篩選出的無土栽培高產(chǎn)花生根系培養(yǎng)基進(jìn)行花生根培養(yǎng)，利用含有生物誘導(dǎo)子

18、的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對花生根進(jìn)行誘導(dǎo)。收集誘導(dǎo)培養(yǎng)基，乙酸乙酯對培養(yǎng)基行進(jìn)液相萃取，對乳化層采用超聲破乳等技術(shù)，進(jìn)一步萃取。收集萃取液進(jìn)行負(fù)壓干燥，備用。
　　 通過薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)對誘導(dǎo)培養(yǎng)基提取物中白藜蘆醇進(jìn)行定性、定量分析，測定誘導(dǎo)至培養(yǎng)基中的白藜蘆醇含量。
　　 四、花生根提取物對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 給予不同濃度花生根提取物預(yù)處理后，炎癥損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞。通過檢測NO、T

19、NF-α了解白藜蘆醇對損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的情況。并通過檢測星型膠質(zhì)細(xì)胞特征性蛋白GFAP，了解星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的情況。最后通過檢測LDH的漏出量，了解花生根提取物對LPS引起星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果:
　　 一、星型膠質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷實驗?zāi)Ｐ偷慕?br>　　 運用微孔濾膜過濾的方法改進(jìn)對乳鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化操作，通過GFAP免疫組化染色鑒定，培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度＞95％。采用不同

20、濃度LPS對細(xì)胞進(jìn)行損傷，細(xì)胞處理一定時間后，隨著LPS濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在同一LPS濃度水平時，細(xì)胞的存活率則隨著損傷時間的延長而下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其中1μg/mlLPS處理24h實驗組，細(xì)胞存活率最接近50％，有利于后續(xù)試驗中觀察白藜蘆醇是否具有保護(hù)作用，亦或是加劇損傷等。因此，本次實驗選用1μg/mlLPS處理24h作為細(xì)胞損傷的條件。
　　 二、白

21、藜蘆醇對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 (1)細(xì)胞存活率:LPS損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞存活率急劇下降至51.04％，三組不同濃度(5、25、50μmol)的白藜蘆醇預(yù)處理細(xì)胞后，細(xì)胞存活率分別為58.72％、76.38％、90.42％，呈濃度劑量關(guān)系遞增。
　　 (2)LDH漏出量:收集上清液檢測LDH漏出，結(jié)果顯示，LPS損傷可導(dǎo)致細(xì)胞LDH漏出量增加(P＜0.05);與LPS處理組相比，5、25、50μmol/L白藜

22、蘆醇預(yù)處理組細(xì)胞LDH漏出量均減少(P＜0.05)，但尤以高濃度RES(50μmol/L)處理組，LDH漏出量減少最為明顯，提示高濃度RES對AS的保護(hù)作用較強。
　　 (3)TNF-α表達(dá)水平:ELISA檢測結(jié)果顯示，LPS處理組細(xì)胞的TNF-α釋放量明顯上升;與LPS處理組相比，25、50μmol/LRES處理組細(xì)胞的釋放量均有下降(P＜0.05)，但5μmol/LRES處理組細(xì)胞TNF-α釋放量與LPS處理組細(xì)胞并無顯著性

23、差異(P＞0.05)。其中，以50μmol/LRES處理組TNF-α釋放量下降最為明顯。提示，高濃度RES對星型膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α釋放量有較明顯抑制作用。
　　 (4)NO表達(dá)水平:LPS處理24h后，NO釋放量明顯上升(P＜0.05);與LPS處理組相比，25、50μmol/LRES處理組細(xì)胞NO釋放量明顯減少(P＜0.05)，而5μmol/LRES對處理組細(xì)胞NO釋放量無明顯影響，與LPS處理組細(xì)胞并無顯著性差異(P＞0.0

24、5)，提示高濃度RES對星型膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放具有抑制作用。
　　 (5)iNOS表達(dá)量:Westernblot法分析結(jié)果顯示，陰性對照組細(xì)胞的iNOS蛋白的表達(dá)水平很低，LPS處理組iNOS蛋白的表達(dá)量與陰性對照組相比明顯上升;與LPS處理組相比:5、25、50μmol/LRES預(yù)處理組iNOS蛋白表達(dá)量均下降。尤其以50μmol/LRES處理組iNOS表達(dá)量下降明顯。提示LPS誘導(dǎo)的NO釋放與iNOS蛋白表達(dá)的上調(diào)有關(guān)，且高濃

25、度RES對iNOS/NO通路有明顯抑制作用。
　　 三、無土栽培高產(chǎn)花生根系誘導(dǎo)白藜蘆醇
　　 利用生物誘導(dǎo)子等活性成分，對高產(chǎn)花生根系進(jìn)行誘導(dǎo)。薄層色譜法鑒定誘導(dǎo)前白藜蘆醇呈陰性、誘導(dǎo)后白藜蘆醇顯示陽性;高效液相色譜法(HPLC)定量結(jié)果，白藜蘆醇含量為564.457μg/gDW，而野生花生根白藜蘆醇含量為51.23μg/gDW，轉(zhuǎn)基因番茄和轉(zhuǎn)基因萵苣白藜蘆醇含量分別為53μg/gDW、56.40μg/gDW。

26、　　 四、花生根粗提物對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 (1)粗提物無毒濃度篩選:cck-8法測定細(xì)胞存活率結(jié)果顯示:與正常對照組相比，粗提物濃度在10-2g/L及其更低濃度之后，細(xì)胞存活率沒有顯著性差異(P＜0.05)。因此，本實驗最終選取10-2g/L、10-3g/L、10-4g/L三個濃度粗體進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞保護(hù)作用研究。
　　 (2)LDH漏出量:不同濃度粗提物(10-2g/L、10-3g/L、10-4g/L)預(yù)處

27、理細(xì)胞，采用LPS損傷細(xì)胞，之后檢測LDH漏出量。結(jié)果顯示:LPS損傷可導(dǎo)致細(xì)胞LDH漏出量增加(P＜0.05)。與LPS處理組相比，三組濃度粗提物L(fēng)DH漏出量均較LPS組有所減少(P＜0.05)，且濃度越高，LDH漏出量越少，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示粗提物對細(xì)胞膜完整性起到了一定的保護(hù)作用。
　　 (3)TNF-α表達(dá)水平:ELISA檢測結(jié)果顯示，LPS處理組細(xì)胞的TNF-α釋放明顯上升;與LPS處理組相比

28、，10-2g/L、10-3g/L粗提物濃度處理組細(xì)胞TNF-α表達(dá)量較LPS處理組降低(P＜0.05)，10-4g/L濃度組與LPS處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 提示:10-2g/L、10-3g/L濃度的粗提物對星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥損傷具有一定的保護(hù)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功利用LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥損傷效應(yīng);
　　 2、LPS誘導(dǎo)炎癥損傷能夠增加星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)遞質(zhì)的釋